[發明專利]唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因載體和轉基因豬及其構建方法

有效

• 申請號: 201310343271.2
• 申請日: 2013-08-07
• 公開（公告）號: CN103695451A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 張獻偉;吳珍芳;賀曉燕;劉德武;李紫聰
• 申請（專利權）人: 吳珍芳;李紫聰
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

1.一種唾液腺組織特異性表達外源蛋白的轉基因載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)利用E2A、P2A和T2A的2A多肽序列將SEQ?ID?NO:1所示的葡聚糖酶基因Bg17、SEQ?ID?NO:2所示的葡聚糖酶基因Eg1314、SEQ?ID?NO:3所示的木聚糖酶基因XynB、以及SEQ?ID?NO:4所示的植酸酶基因APPA構建重組β-葡聚糖酶基因-木聚糖酶基因-植酸酶基因融合基因BgEgXyAp；

(2)、分別以質粒pcDNA3.1(+)和pT2AL200R175-CAGGS-EGFP為模板，SEQ?ID?NO:5和SEQ?ID?NO:6、及SEQ?ID?NO:7和SEQ?ID?NO:8為引物進行第一次PCR擴增，獲得帶有若干重疊序列的neo基因和EGFP基因；各取0.5-3μL混合后作為模板進行第二次PCR擴增，純化得到neo-EGFP融合基因；用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切pcDNA3.1(+)和neo-EGFP融合基因，純化回收酶切產物，連接，構建得到pcDNA-Neo-T2A-EGFP載體；

(3)、以質粒pPB-UbC-EGFP-neo為模板，分別以SEQ?ID?NO:9和SEQ?ID?NO:10、及SEQ?ID?NO:11和SEQ?ID?NO:12作為引物，進行PCR擴增得到NotⅠ-5-PB-NotⅠ，XhoⅠ-3-PB-XhoⅠ，分別采用NotⅠ和XhoⅠ酶切后，連接在載體pPSPBGPneo-XynB上，得到載體pPSPBGPneo-PB-XynB；

(4)、以步驟(2)得到的pcDNA-neo-T2A-EGFP載體為模板，用長片段PCR體系，SEQ?ID?NO:13和SEQ?ID?NO:14作為引物進行PCR擴增得到infusion-CMV-neo-T2A-EGFP片段，切膠純化；用ClaⅠ和BglⅡ雙酶切步驟(2)得到的載體pPSPBGPneo-PB-XynB，對目的片段切膠純化；將infusion-CMV-neo-T2A-EGFP片段重組到pPSPBGPNeo-PB-XynB載體的兩個loxp位點中間，得到pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB載體；

(5)、以步驟(4)得到的pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB載體為模板，SEQ?ID?NO:15和SEQ?ID?NO:16作為引物，進行PCR擴增，得到載體中的pPB-lox-neoEGFP-loxp片段，并添加AgeI限制性內切酶位點，純化，得到新載體骨架；

(6)、以小鼠腮腺蛋白基因上游調控區的PCR擴增片段為模板，SEQ?ID?NO:17和SEQ?ID?NO:18為引物，擴增得到小鼠腮腺蛋白上游調控區的下游4009bp片段，將4009bp片段與新載體骨架pPB-lox-neoEGFP-loxp中的重組序列進行重組，得到中間載體1；

(7)、以小鼠腮腺蛋白基因上游調控區的PCR擴增片段為模板，以SEQ?ID?NO:19和SEQ?ID?NO:20為引物，擴增得到小鼠腮腺蛋白上游調控區的下游4706bp片段；將其重組到步驟(6)的中間載體1的StuI位點，即為中間載體2；

(8)、以小鼠腮腺蛋白基因上游調控區的PCR擴增片段為模板，以SEQ?ID?NO:21和SEQ?ID?NO:22為引物，利用AgeI位點，擴增得到小鼠腮腺蛋白上游調控區的下游3956bp片段；將其重組到步驟(7)的中間載體2上，得到載體pPB-MusPSP-neo-EGFP；

(9)、將步驟(1)得到的β-葡聚糖酶基因-木聚糖酶基因-植酸酶基因融合基因BgEgXyAp用in-fusion重組酶重組到步驟(8)得到的載體pPB-MusPSP-neo-EGFP的ASCI位點，即得序列號為SEQ?ID?NO:35的四基因共表達的表達載體pPB-MusPSP-neo-EGFP-BgEgXyAp。