[發明專利]一種定向篩選同源重組PGC的載體及構建方法和應用

有效

• 申請號: 201310341471.4
• 申請日: 2013-08-06
• 公開（公告）號: CN103397046A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發明（設計）人: 孫永華;熊鳳;魏志強;朱作言
• 申請（專利權）人: 中國科學院水生生物研究所
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于魚類生物工程技術領域，本發明涉及一種定向篩選同源重組PGC的載體，還涉該載體的制備方法，還涉及該載體在定向篩選斑馬魚同源重組PGC中的應用，本發明的定向篩選同源重組PGC的載體可以高效地利用同源重組技術制備帶有特定遺傳修飾的斑馬魚品系。?

背景技術

同源重組技術是構建基因敲除小鼠模型最普遍使用的方法，其基本步驟是：首先將打靶載體轉入小鼠胚胎干細胞中；再通過合適的篩選系統鑒定出發生了同源重組的胚胎干細胞；然后通過嵌合體技術將遺傳修飾過的胚胎干細胞培養成小鼠個體，從而制備出帶有特定基因失活或者缺失的小鼠(Schafer,C.(2007).“Nobel?Prize?in?medicine.Knockout?mice?revolutionize?genetics”.Unfallchirurg.110,1082-1084.)。因此，同源重組技術和胚胎干細胞技術為小鼠中進行基因敲除奠定了基礎。然而，在魚類中，盡管同源重組事件也同樣存在，由于尚沒有建立把體外培養的細胞株轉變成為個體魚的技術，但是利用同源重組進行基因打靶的研究并不多（Liu,J.,Gong,L.,Chang,C.,Liu,C.,Peng,J.and?Chen,J.(2012)Development?of?novel?visual-plus?quantitative?analysis?systems?for?studying?DNA?double-strand?break?repairs?in?zebrafish.J?Genet?Genomics39,489-502）。?

值得注意的，在小鼠中的嵌合體技術中，移植的胚胎干細胞只有發育為生殖細胞才能將遺傳修飾傳遞下去，所以胚胎干細胞和嵌合體技術的最終目標是希望將遺傳修飾作用到生殖細胞基因中。斑馬魚魚具有產卵量大的優勢，如果直接將斑馬魚的PGC作為基因打靶的對象，PGC是將來要發育為生殖細胞的胚胎細胞，篩選出PGC打靶成功的胚胎就能成功地將遺傳修飾傳遞下去。?

但是，由于同源重組在動物中發生率只有10^-2～10^-5，如何篩選出發生了同源重組的細胞非常重要。在小鼠中應用最多的是正負篩選法，比如常用藥物G418篩選所有能表達正篩選基因neo的細胞，然后用Ganciclovir淘汰表達單純皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶（HSV-TK）的細胞，剩下的細胞為發生了同源重組的細胞。然而，基于藥物G418和Ganciclovir的正負篩選系統卻不能在斑馬魚胚胎中使用。由于沒有合適的篩選系統，Zu等人利用同源重組在斑馬魚中進行基因打靶，結?果經過了繁重的篩選工作才篩選出能夠將發生了同源重組傳遞下去的斑馬魚(Zu,Y.,Tong,X.,Wang,Z.,Liu,D.,Pan,R.,Li,Z.,Hu,Y.,Luo,Z.,Huang,P.,Wu,Q.,Zhu,Z.,Zhang,B.and?Lin,S.(2013)TALEN-mediated?precise?genome?modification?by?homologous?recombination?in?zebrafish.Nat?Methods.10,329-331.)。因此，為了能夠在斑馬魚中實現基因打靶并在細胞水平上對胚胎進行早期篩選，有必要在生殖細胞中建立高效的正篩選系統。?