[發(fā)明專利]利用雙熒光素酶報告基因確定關(guān)嶺牛MyoDⅠ基因核心啟動子的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310341205.1
• 申請日: 2013-08-07
• 公開（公告）號: CN103571941A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 許厚強(qiáng);李飛;陳偉;陳祥;趙佳福
• 申請（專利權(quán)）人: 貴州大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/66
• 代理公司: 貴陽中新專利商標(biāo)事務(wù)所 52100
• 代理人: 李亮;程新敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，尤其是一種利用雙熒光素酶報告基因確定關(guān)嶺牛MyoDⅠ基因核心啟動子的方法。?

背景技術(shù)

MyoDⅠ的全稱為myogenic?differentiation?Ⅰ，其中文名稱為生肌決定因子，是骨骼肌生長發(fā)育過程中重要的正調(diào)控基因，在肌形成肌肉特異基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，MyoDⅠ起著總開關(guān)的作用，可以結(jié)合到肌細(xì)胞生成素(myogenin)、肌酸激酶CK、肌球蛋白、結(jié)蛋白等基因啟動子區(qū)發(fā)揮重要調(diào)控作用，促進(jìn)它們的轉(zhuǎn)錄激活。MyoDⅠ介導(dǎo)的肌分化機(jī)制作為研究細(xì)胞分化的最佳模型，已成為當(dāng)前眾多學(xué)者研究的焦點(diǎn)，尤為重要。目前，國內(nèi)外對該基因的表達(dá)調(diào)控在小鼠、雞和豬的肌細(xì)胞生成機(jī)理等方面的相關(guān)研究較多，在牛上已有一些研究，包括遺傳變異及功能研究等，但主要集中在轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平，MyoDⅠ基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制尚不清楚。因此，MyoDⅠ基因啟動子的研究具有廣闊的研究前景，以期為轉(zhuǎn)基因牛的培育和牛肉品質(zhì)的提高提供理論依據(jù)。?????生肌決定因子MyoDⅠ的主要功能包括：（1）促使靜止期的肌衛(wèi)星細(xì)胞向成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。（2）能把許多種類型細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成肌細(xì)胞，并可促進(jìn)成肌細(xì)胞進(jìn)一步融和、分化為成熟的肌纖維。?

pGL3-Basic是一類常用的報告基因，因其無啟動子和增強(qiáng)子，可通過熒光素酶報告基因的表達(dá)來檢測插入片段的啟動活性，并且比較啟動子的強(qiáng)弱和骨骼肌特異性，進(jìn)而初步確定核心啟動子區(qū)域。?

發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)要求?

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用雙熒光素酶報告基因確定關(guān)嶺牛MyoDⅠ基因核心啟動子的方法，它具有靈敏度高、檢測速度快、費(fèi)用低、不需使用放射性同位素等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：利用雙熒光素酶報告基因確定關(guān)嶺牛MyoDⅠ基因核心啟動子的方法，包括以下步驟：?

步驟1）、構(gòu)建含關(guān)嶺牛MyoDⅠ基因啟動子全長片段和亞克隆片段的重組載體；

步驟2）、對骨骼肌生長相關(guān)的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和鋪板；

步驟3）、配制啟動子重組子/脂質(zhì)體的混合物，對步驟2）獲得的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染；

步驟4）、通過雙熒光素酶報告基因?qū)Σ襟E3）獲得的轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測。

步驟4）中所述的雙熒光素酶報告基因為螢火蟲熒光素酶基因。?

所述的雙熒光素酶活性檢測所采用的工作液是通過promega?試劑盒配制獲得。?

步驟1）中所采用的引物為8對，引物P0的上游引物的序列為：5′-ACCTCCCGACATCATACATT-3′，引物P0的下游引物的序列為：5′-GAAACCCAGCCGCATCTA-3′；引物P1的上游引物的序列為：5′-?ACCTCCCGACATCATACATT-3′，引物P1的下游引物的序列為：5′-?GGTTTGGGTTGCTAGACG-3′；引物P2的上游引物的序列為：5′-?GTGGAGTTCCGCTTGTTG-3′，引物P2的下游引物的序列為：5′-?GGTTTGGGTTGCTAGACG-3′；引物P3的上游引物的序列為：5′-?GATATGGAGCTGCTGTCGC-3′，引物P3的下游引物的序列為：5′-?AGCCGCTGGTTTGGGTTGC-3′；引物P4的上游引物的序列為：5′-?GTGGAGTTCCGCTTGTTG-3′，引物P4的下游引物的序列為：5′-?CTCCCCACCCCTACTTTC-3′；引物P5的上游引物的序列為：5′-?CTCCCTGATTCGGTAGATC-3′，引物P5的下游引物的序列為：5′-?CTCCCCACCCCTACTTTC-3′；引物P6的上游引物的序列為：5′-?CTCCCTGCTCTGTTCCTATT-3′，引物P6的下游引物的序列為：5′-?AAACTTGCTGCTGTTCTGG-3′；引物P7的上游引物的序列為：5′-?TTAGGCTACTACGGGATAAA-3′，引物P7的下游引物的序列為：5′-?CTCCCCACCCCTACTTTC?-3′。?

有益效果?

（1）本發(fā)明提供的方法具有靈敏度高、檢測速度快、費(fèi)用低、不需使用放射性同位素等優(yōu)點(diǎn)。

(2)?本發(fā)明使用的pGL3-Basic報告基因，因其無啟動子和增強(qiáng)子，可通過熒光素酶報告基因的表達(dá)來檢測插入啟動子的啟動活性，并且比較啟動子的強(qiáng)弱，進(jìn)而初步確定核心啟動子區(qū)域。?

附圖說明

圖1為本發(fā)明所使用的技術(shù)路線；?