[發明專利]用于葉籽銀杏MSAP分析的DNA提取方法

無效

• 申請號: 201310334067.4
• 申請日: 2013-08-02
• 公開（公告）號: CN103421765A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 邢世巖;王聰聰;付兆軍
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，特別是一種用于葉籽銀杏MSAP分析的DNA提取方法。?

背景技術

銀杏是第四紀冰川運動后現存種子植物中最古老的孑遺植物，而葉籽銀杏作為銀杏家族中的一個特異種質，具有重要的科研和觀賞價值。目前關于葉籽銀杏的研究多集中在形態特征的描述、解剖特征和細胞生物學方面，分子生物學方面的研究很少，而基因組DNA和RNA的提取是葉籽銀杏分子生物學研究的基礎。?

目前DNA提取的方法主要有：濃鹽法、陰離子去污劑法、苯酚抽提法和水抽提法。從提取原理上看主要有CTAB法和SDS法。葉籽銀杏葉片具有多糖多酚等物質含量高的特點，一般DNA提取方法獲得的DNA因為雜質較多無法進行MSAP的分析。DNA是葉籽銀杏分子生物學研究的基礎，DNA的提取對于葉籽銀杏的研究有至關重要的作用，MSAP技術是以DNA為模板，通過DNA基因組的酶切、連接、預擴增、選擇性擴增、和聚丙烯酰胺凝膠電泳，分析葉籽銀杏DNA甲基化的水平和模式變化的技術。DNA酶切是否充分是驗證DNA純度的一個重要指標。然而，葉籽銀杏因為其自身的特點，DNA提取過程中多糖多酚、蛋白質、RNA污染等情況嚴重，嚴重制約了葉籽銀杏的分子生物學研究。?

一般的DNA提取方法在葉籽銀杏基因組提取過程中存在以下不足：（1）獲得的DNA濃度較低。（2）DNA純度不高，蛋白質、多糖等雜質含量高，嚴重影響葉籽銀杏MSAP的分析。（3）成本高，操作步驟并不簡單。上述問題在一定程度上制約了葉籽銀杏分子生物學的研究。截止目前，還未見成本較低、操作方便、可獲得葉籽銀杏較高濃度DNA的方法的報道，本發明是在這樣的技術背景下提出的。?

發明內容

本發明的目的是，針對葉籽銀杏多糖多酚含量高的特點，為提高葉籽銀杏DNA提取的質量，提出一套完整的用于葉籽銀杏MSAP分析的DNA提取方法。以實現降低成本、簡化操作步驟、為葉籽銀杏分子生物學研究奠定基礎的目的。?

為了達到上述目的，本發明采用了以下技術方案：?

（1）研缽、研錘、藥匙、2ml及1.5ml離心管等高壓滅菌，液氮準備，2%CTAB、TE等試劑的配制，CTAB在65℃水浴鍋中預熱10min以上。?

（2）稱新鮮嫩葉.015g-0.20g，迅速倒入預冷的研缽中，倒入液氮迅速研磨，多次研磨至粉末狀，立即轉入裝有700μL預熱CTAB的2mL離心管中，加入35μLβ-巰基乙醇和20％PVP140μL，充分混勻；?

（3）65℃溫浴30min以上，中間顛倒離心管搖動3-5次，取出后冷卻至室溫；?

（4）加入等體積的氯仿異戊醇[24：1（V/V）]，輕輕顛倒混勻，室溫12000rpm離心10min；?

（5）吸取上清轉入2mL的離心管中，加入2倍體積的無水乙醇，然后加入20μL3mol.L^-1NaAc，一般離心管內會有棉團狀DNA出現，-20℃冰箱中放置30min以上；?

（6）3000rpm離心6min，棄上清，用70％乙醇洗滌2次，放置30min左右自然風干；?

（7）加600μL?TE充分溶解DNA；?

（8）加入等體積的酚：氯仿：異戊醇[25：24：1（V/V）]，顛倒混勻，12000rpm離心10min；?

（9）吸取上清，加入等體積的氯仿：異戊醇，輕輕顛倒混勻，12000rpm離心10min；?

（10）吸取上清轉入2mL的離心管中，然后加入30μL3mol/L?NaAc，一般離心管內會有棉團狀DNA出現，-20℃冰箱中放置30min以上；?

（11）3000rpm離心6min，棄上清，用70％乙醇洗滌2次，再用無水乙醇洗滌1次，自然風干；?

（12）加60μL?TE充分溶解DNA；?

（13）待溶解后，加入4μL5mg/mL?RNA酶，37℃水浴30min，冷卻至室溫，分裝后4℃保存備用，-20℃長期保存；?

本發明的有益效果是：?

（1）由于采用了高濃度的β-巰基乙醇和PVP，從而解決了DNA中多糖多酚等雜質的污染。?

（2）酚：氯仿：異戊醇和氯仿：異戊醇反復抽提，有效促進DNA的變性，同時抑制了DNase的降解，使蛋白分子溶于酚相，DNA溶于水相，同時，氯仿抽提能去除核酸溶液中的跡量酚。?

（3）傳統的DNA提取技術不能有效的去除葉籽銀杏DNA中的雜質，并且成本高，本技術可以獲得葉籽銀杏高質量的DNA，以用于葉籽銀杏MSAP的分析。?