[發明專利]羅丹明B的酶聯免疫試劑盒及其組建和檢測方法

有效

• 申請號: 201310333731.3
• 申請日: 2013-08-03
• 公開（公告）號: CN103454429A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 張改平;胡驍飛;王棟;張靜;職愛民;王方雨
• 申請（專利權）人: 河南百奧生物工程有限公司;河南省農業科學院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 鄭州金成知識產權事務所(普通合伙) 41121
• 代理人: 郭增欣

1.一種檢測羅丹明B的酶聯免疫試劑盒，其中包括：羅丹明123特異性抗體、羅丹明123與載體蛋白的偶聯物和酶標二抗、包被羅丹明123抗原或特異性抗體的酶標板，羅丹明B標準溶液、底物顯色液、洗滌液、終止液；其中羅丹明123特異性抗體為羅丹明123的多克隆抗體。

2.根據權利要求1所述的酶聯免疫試劑盒，其特征是：所述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清白蛋白或鑰孔銅藍蛋白；????????????????????????????????????????????????所述酶標二抗為辣根過氧化物酶或羊抗兔IgG抗體。

3.根據權利要求1所述的酶聯免疫試劑盒，其特征是：所述的洗滌液為含

有0.05%-0.5%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，所述終止液為2mol/L的鹽酸。

4.4．根據權利要求1所述的酶聯免疫試劑盒，其特征是：所述的底物顯色液由顯色劑A和顯色劑B組成，顯色劑A為過氧化氫或過氧化脲，顯色劑B為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺。

5.根據權利要求1-4任一項所述的酶聯免疫試劑盒，其特征是：所述試劑盒還包括濃縮樣品稀釋液，濃縮樣品稀釋液為含0.1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液；

用于制備酶標板的固相材料為聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙烯。

6.根據權利要求1-4任一項所述的酶聯免疫試劑盒，其特征是：所述羅丹明123與載體蛋白的偶聯物是由以下方法得到的：

（1）稱取3mg的羅丹明123和3mg的琥珀酸酐溶于3?mL?0.01?mol/L?pH?7.4的PBS緩沖液中，室溫下反應3小時后，向反應液加入7.3?mg二環己基碳二亞胺和4.5?mg?N-羥基琥珀酰亞胺，在4℃反應條件下過夜反應，得到的反應液為A液；

（2）?稱取40?mg的牛血清白蛋白溶于2mL?0.01?mol/L?pH?7.4的PBS緩沖液中，得到B液；

（3）在室溫磁力攪拌下，將A液逐滴加入B液中，4℃反應9?h；

（4）用PBS透析3天，換液3次/天；透析完成后，4000r/min離心5min，取上清液，得到羅丹明123與載體蛋白的偶聯物。

7.根據權利要求6所述的酶聯免疫試劑盒，其特征是：所述羅丹明123的多克隆抗體是由以下方法制備的：

將制得的羅丹明123與載體蛋白的偶聯物用生理鹽水稀釋成1mg/mL的溶液，將其與等量弗氏完全佐劑混合，然后用勻漿儀以20000r/min的轉速充分乳化；

選體重在2-3kg的健康雄性新西蘭大白兔，用所述的乳化液在大白兔背部皮下多點注射進行首次免疫；每隔2周加強免疫，除用弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑外，其他劑量和方法同首次免疫；三免后每次免疫后10天，耳緣靜脈采血1mL，進行抗體效價檢測；當效價停止繼續升高時，直接用免疫原進行最后一次免疫，腿部肌肉注射，第8天頸動脈采集血液，室溫凝固2h后4℃過夜，6000r/min離心10min，取血清部分用50%的飽和硫酸銨溶液沉淀，離心去上清液，沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸，再用33%飽和硫酸銨溶液進行2次沉淀，沉淀物用磷酸鹽緩沖液溶解，透析后即得到羅丹明123的多克隆抗體。

8.一種權利要求1的檢測羅丹明B酶聯免疫試劑盒的組建方法，其特征在于：該方法包括盒體內的羅丹明123多克隆抗體的制備；羅丹明123與載體蛋白偶聯物的制備；

所述羅丹明123與載體蛋白偶聯物的制備方法如下：

（1）稱取3mg的羅丹明123和3mg的琥珀酸酐溶于3?mL?0.01?mol/L?pH?7.4的PBS緩沖液中，室溫下反應3小時后，向反應液加入7.3?mg二環己基碳二亞胺和4.5?mg?N-羥基琥珀酰亞胺，在4℃反應條件下過夜反應，得到的反應液為A液；

（2）?稱取40?mg的牛血清白蛋白溶于2mL?0.01?mol/L?pH?7.4的PBS緩沖液中，得到B液；

（3）在室溫磁力攪拌下，將A液逐滴加入B液中，4℃反應9?h；

（4）用PBS透析3天，換液3次/天；透析完成后，4000r/min離心5min，取上清液，得到羅丹明123與載體蛋白的偶聯物。

9.一種檢測樣品中羅丹明B含量的方法，包括步驟：

（1）樣品前處理；

（2）用權利要求1-7任一項所述的試劑盒進行檢測，向包被有羅丹明123抗原的酶標板孔中加入標準品或樣品溶液，再加入羅丹明123多克隆抗體，孵育后洗滌拍干，加入酶標記二抗，孵育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標儀測吸光度值；

（3）分析檢測結果。