[發明專利]一種提取絲狀真菌基因組DNA的方法及試劑盒和遺傳轉化子的快速篩選方法

有效

• 申請號: 201310326924.6
• 申請日: 2013-07-30
• 公開（公告）號: CN103361339A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 潘力;周斌;何攀;呂揚勇
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/69
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 宮愛鵬

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種絲狀真菌DNA提取試劑盒及提取方法和一種絲狀真菌遺傳轉化子快速篩選方法。

背景技術

絲狀真菌廣泛存在于自然界中,在工業、農業、醫藥以及基礎生物學研究中具有重要作用，多年來一直被廣泛地研究。隨著分子技術的發展，絲狀真菌的遺傳轉化在理論上和應用上均取得了較大的進展（閆培生等，1999）。當前絲狀真菌轉化體系遇到的主要問題是如何高通量篩選遺傳轉化子。普通的菌落PCR不能適用于細胞壁結構復雜的絲狀真菌（潘力等，2009）。雖然潘力等在絲狀真菌菌落PCR有一些改良方法運用，但在實踐中發現該方法還是存在一些缺陷，例如挑取的菌絲菌齡較老和挑取的菌絲量過多時，假陰性現象嚴重；如果挑取的菌絲污染了培養基，則出現假陽性現象。因此基因組DNA快速提取對轉化子驗證是一個急需解決的問題。目前提取基因組DNA最常用的方法是CTAB法（Walker?WH等,1991）和SDS法，但是這些方法均需要液氮研磨，操作繁瑣且耗時長，而苯酚和氯仿的使用可能導致有機溶劑殘留在基因組樣品中從而造成下游試驗無法順利進行，這些因素嚴重影響了實驗進度。雖然市場上也有一些提取基因組的試劑盒，可以提取到高質量基因組DNA，但成本較高、操作同樣復雜，耗時長（至少1個小時），有的公司開發的試劑盒同樣會用到苯酚和氯仿試劑，這也不利于我們大規模篩選轉化子。

傳統的絲狀真菌遺傳轉化子篩選方法是：將轉化平板上的轉化子挑選到篩選平板上，然后收集孢子，液體搖瓶培養，收集菌絲，液氮研磨，提取基因組驗證。整個過程耗時耗力，而且篩選效率低。基于本發明的試劑盒開發的一種絲狀真菌遺傳轉化子快速篩選方法，省時省力。本發明方法只需將轉化平板上的轉化子挑選到篩選平板上，然后直接從平板上挑取少量菌絲，試劑盒提取基因組進行轉化子的進一步驗證。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種從絲狀真菌中快速提取基因組的方法及試劑盒，從而解決了傳統絲狀真菌基因組DNA提取方法中耗時長、使用有毒的有機試劑、雜質多等問題。

本發明的目的之二是提供一種絲狀真菌遺傳轉化子快速篩選的方法，從而解決了傳統絲狀真菌轉化子篩選方法費時費力、篩選效率低等問題。

本發明的目的通過以下技術方案實現：

一種絲狀真菌DNA提取試劑盒，包括電動研磨器、溶液A(裂解液)、溶液B（DNA結合液）、溶液C（DNA洗滌液）、溶液D（DNA洗脫液）和DNA吸附柱；其中，

溶液A：10-50mM?Tris-HCl，10-50mM?EDTA-2Na，1%-10%w/v?SDS，2-4M?NaCl，0.5%-2%v/v的β-巰基乙醇，pH8.0；

溶液B：2.5-6M的鹽酸胍或異硫氰酸胍，20%-50%v/v異丙醇或無水乙醇，5mM-20mM?EDTA-2Na，pH4.5-6.5；

溶液C：70%-80%v/v的無水乙醇，pH4.5-6.5；

溶液D：5-50μg/mL的RNA酶水溶液，用1M?NaOH溶液將pH調到≤8.5的堿性。

上述試劑盒的優選配方如下：

溶液A：50mM?Tris-HCl、50mM?EDTA-2Na、3%SDS、2MNaCl、1%的β-巰基乙醇，pH8.0；

溶液B：4M的鹽酸胍、20%異丙醇、10mM?EDTA-2Na、pH5.0的0.2M的乙酸-乙酸鈉緩沖液；

溶液C：70%的無水乙醇、pH5.0的0.2M的乙酸-乙酸鈉緩沖液；

溶液D：20μg/mL的RNA酶水溶液，用1M?NaOH溶液將pH調到8.0。

所述電動研磨器的轉速1500-9000rpm，并配有70mm的錐形研磨杵。

所述電動研磨器的轉速為1800rpm。

所述DNA吸附柱為硅膠柱。

利用上述試劑盒提取絲狀真菌DNA的方法，包含以下步驟：

（1）將70μL-100μL的溶液A和0.1mg-100mg菌體混合；開動電動研磨器研磨菌體1-2min；向研磨好的菌絲中加入溶液A使樣品終體積為150μL；

（2）漩渦振蕩器震蕩30s，使菌體盡量分散；轉速10000g-12000g，離心5min；取上清100μL至離心管中，加入300μL-600μL的溶液B，上下顛倒混勻；