[發(fā)明專利]一種全能干細胞培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310324834.3
• 申請日: 2013-07-30
• 公開（公告）號: CN103396987A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓雪;林慧盈;王猛;劉興宇
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州微基質(zhì)生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12N5/07
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 林松海

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明的目的在于提供一種全能干細胞培養(yǎng)的方法，特別是提供了一種胚胎干細胞（ESCs）或者誘導(dǎo)全能干細胞（iPSCs）的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

干細胞是能夠分化為多種細胞類型的細胞。來自于胚胎期的干細胞和通過再誘導(dǎo)方式產(chǎn)生的類似胚胎期的全能干細胞iPSCs，能夠分化成為生物個體絕大部分細胞類型。這兩種細胞可以在體外培養(yǎng)中無限增值，為再生醫(yī)學(xué)研究和產(chǎn)業(yè)提供基礎(chǔ)材料。然而，無論是ESCs還是iPSCs在細胞培養(yǎng)中都容易死亡，尤其是靈長類動物如人的干細胞。而這種死亡尤其發(fā)生在細胞的傳代的過程中，無論傳代是以機械塊狀的方式還是通過酶消化分散的方式，都難以避免。

另一方面，在胚胎干細胞ESCs和誘導(dǎo)產(chǎn)生的全能干細胞iPSCs的培養(yǎng)系統(tǒng)中一直使用基質(zhì)膠（Matrigel）作為作為鋪板材料。但是Matrigel具有化學(xué)成分不確定，批次質(zhì)量不穩(wěn)定等問題。這些問題對于無論是基礎(chǔ)科研和臨床使用都將帶來很多弊病。因此有必要尋找一種能夠替代Matrigel的化學(xué)組分確定，且易于生產(chǎn)保存的細胞外基質(zhì)的替代品。

Nature?Biotechnology描述了采用重組laminin（Nat?Biotechnol.?2010?Jun;28(6):611-5）和采用從Vitronectin提取的多肽（Nat?Biotechnol.?2010?Jun;28(6):606-10.?）來代替Matrigel用于以上描述的干細胞培養(yǎng)的方式。但是重組laminin成本仍然極其高昂；而來源于Vitronectin的兩種測試的多肽被提示能夠特異性的提供整合素alpha?v?beta?3的粘合，從而使干細胞生長。

細胞外基底膜是定義體內(nèi)組織邊界的細胞外基質(zhì)，通常存在于上皮細胞層，內(nèi)皮細胞層和神經(jīng)細胞的下部，具有廣泛的生理學(xué)功能。基底膜的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是由不同種類的細胞外基質(zhì)蛋白相互作用形成網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)而形成。其中最重要的為層粘連蛋白（laminins）和四型膠原蛋白（type?IV?collagen），以這兩種主要蛋白為基礎(chǔ)的基底膜結(jié)構(gòu)是高度保守的，廣泛地存在于無脊椎動物和脊椎動物組織結(jié)構(gòu)中。從發(fā)育學(xué)來看，脊椎動物的個體發(fā)育第一次形成基底膜是在胚囊（blastocyst）期的內(nèi)細胞群（inner?cell?mass?，ICM)中，ICM的形成使得ICM繼續(xù)分化成兩層細胞?-內(nèi)胚層（hypoblast）?和外胚層（epiblast）。這兩層細胞以基底膜隔開，背向相對。Epiblast可以用于衍生出胚胎干細胞，也代表了在個體的自然發(fā)育過程中的最后時期的全能干細胞。成功接種在體外的全能干細胞完全具有和上皮細胞高度相似的結(jié)構(gòu)特性—具有極性分布的細胞通過密封連接（tight?junction）連接起來。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了全能干細胞培養(yǎng)方法。

?全能干細胞培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

1）用人工合成的包含氨基酸序列為NCKHQCTCIDGAVGCIPLCP（SEQ?ID?NO：1）的多肽水溶液作為細胞外基質(zhì)，鋪于細胞培養(yǎng)皿表面；

2）將全能干細胞接種于所述的細胞培養(yǎng)皿表面；

3）加入無飼養(yǎng)層培養(yǎng)基，進行全能干細胞的培養(yǎng)傳代。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，步驟1）中所述的多肽的氨基酸序列為NCKHQCTCIDGAVGCIPLCP（SEQ?ID?NO：1）。

作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選方案，所述的多肽水溶液濃度為0.01mg/ml～20mg/ml；優(yōu)選的濃度為0.1-10mg/ml?，進一步更為優(yōu)選的濃度為0.2-5mg/ml，再進一步更為優(yōu)選的濃度為0.5-2mg/ml。

作為本發(fā)明的又一種優(yōu)選方案，所述的多肽水溶液作為細胞外基質(zhì)，鋪于細胞培養(yǎng)皿表面方法為，用移液槍吸取0.1mL的所述的多肽水溶液，移入細胞培養(yǎng)皿中，晃動，搖勻，均勻分布于培養(yǎng)皿底部，然后將所述的多肽水溶液覆蓋的細胞培養(yǎng)皿在37℃±1℃下放置3～12小時。多肽通過共價鍵、靜電、疏水作用等吸附方式固定于培養(yǎng)用表面上。

作為本發(fā)明的進一步的優(yōu)選方案，步驟2）中，全能干細胞接種前經(jīng)過以下處理步驟：

????1）解凍；或已經(jīng)在連續(xù)的培養(yǎng)之中的全能干細胞不需要解凍；

????2）使用剪切酶或EDTA使全能干細胞脫離原培養(yǎng)表面。處理后得到的全能干細胞團接種于所述的細胞培養(yǎng)皿表面。

作為本發(fā)明的再一個的優(yōu)選方案，步驟3）中的所述的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)基，包括以下組分：水、礦物質(zhì)、維生素、氨基酸、葡萄糖、成纖維細胞生長因子、