[發明專利]黃曲霉毒素M1金標快速檢測卡及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201310317618.6
• 申請日: 2013-07-25
• 公開（公告）號: CN103412124A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 何艷玲;王麗麗;唐慧林;趙瑜;于重楠;王麗哲;劉敏;李瑾
• 申請（專利權）人: 北京陸橋技術有限責任公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/558
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種黃曲霉毒素M1金標快速檢測卡，所述檢測卡包括檢測條和塑料卡殼，所述檢測條由樣品墊、金標抗體結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊組成；所述金標結合墊為包被有膠體金顆粒標記的黃曲霉毒素M1單克隆抗體的玻璃纖維、硝酸纖維素膜包被有隱性黃曲霉毒素M1蛋白偶聯物的檢測線（T線）以及羊抗鼠單克隆抗體的控制線（C線）。?

2.如權1中所述黃曲霉毒素M1金標快速檢測卡，其特征在于金標結合墊上的膠體金顆粒標記的黃曲霉毒素M1單克隆抗體是黃曲霉毒素M1單克隆抗體與25um的膠體金顆粒通過物理方法結合在一起的產物，抗體標記量為3ug/ml。?

3.如權1所述黃曲霉毒素M1金標快速檢測卡，其特征在于所述檢測線上包被的黃曲霉毒素M1蛋白偶聯物的濃度為0.1mg/ml，包被量為1μl/cm；控制線上包被的羊抗鼠單克隆抗體的濃度為1mg/mL，包被量為1μl/cm。?

4.一種權種要求1所述的黃曲霉毒素M1金標快速檢測卡的制備方法，包括以下步驟：?

1）金標抗體結合墊的制備?

a.空白膠體金的制備：?

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，制備方法為用量筒量取濃度為0.01%的氯金酸溶液100ml，加入帶有磁力攪拌子的燒瓶內，置于加熱磁力攪拌器上高速加熱攪拌，等液體完全沸騰后加入濃度為1%的檸檬酸三鈉溶液1.5ml；當溶液的顏色轉變為桔紅色且不再發生變化時保持沸騰狀態10min，10min后取下燒瓶于室溫自然冷卻，最后取出轉子，4℃避光冷藏保存；?

b.金標抗體重懸液的配制?

第一步用分析天平稱取Tris0.605g，加入1L燒杯中；?

第二步用分析天平稱取蔗糖25.000g,加入以上燒杯中；?

第三步500ml量筒量取純水500ml，加入上述燒杯中，使其充分溶解；?

第四步于磁力攪拌器上溫和攪拌，使各組份充分溶解、混勻；?

第五步將上述液體用4NHCl調節pH值至8.2±0.1；?

第六步用分析天平稱取牛血清白蛋白（BSA）5.000g，加入以上燒杯中；?

第七步再次于磁力攪拌器上溫和攪拌，使BSA充分溶解、混勻；?

第八步將上述液體用0.22um微孔濾膜無菌過濾，過濾后的液體裝入500ml試劑瓶中，貼簽，4℃備用，保存有效期2個月；?

c.膠體金標記抗體的制備：?

取空白膠體金溶液100ml于三角燒瓶中，置磁力攪拌器上低速攪拌，加入0.1M碳酸鉀溶液150～200ul，保持7-10分鐘后，在攪拌狀態下緩慢加入濃度為0.2mg/ml的黃?曲霉毒素M1單克隆抗體進行抗體膠體金標記，使抗體終濃度達到3ug/ml，繼續攪拌30min后逐滴加入25%的BSA溶液使之終濃度達到0.4%，持續攪拌30min，最后離心，棄去未結合的游離蛋白，用金標抗體重懸液將沉淀金標抗體充分重懸后備用；?

d.金標抗體結合墊的制備：?

將重懸好的金標抗體包被于預先切割好的尺寸為1cm*30cm的玻璃纖維素膜上，包被量為2ml/30cm，37℃干燥過夜，密封避光干燥處保存；?

2）包被膜上T、C線的包被?

a.黃曲霉毒素M1-蛋白偶聯物的制備?

2mgAFM₁與4mgCMO溶解于400μl吡啶中，25℃避光振搖反應24h后將反應產物冷凍干燥；稱取0.2mg的反應物溶于100μlDMF-水中，加入EDC30mg，避光混勻；再加入0.5%OVA溶液，25℃避光、100r/min反應4h，再補加EDC5-10mg，繼續反應20h。將偶聯產物裝入透析袋，在0.01mol/LPBS中置4℃透析袋3天，期間換透析液3次；

b.T、C線的包被?

調試好二維噴點平臺，將權利3中配制好的蛋白偶聯物通過劃線的方式按順序包被在硝酸纖維素膜上作為檢測線，同時進行羊抗鼠單克隆抗體的包被作為控制線，37℃干燥2h，密封避光干燥處保存；?

3）試紙條的組裝?

按權1中的要求將樣品墊、金標抗體結合墊、硝酸纖維素膜以及吸水墊按序搭接黏貼在PVC底板上，將貼好的底板在切條機上切割成寬為4mm的試紙條，最后固定在塑料卡殼內。?

5.根據權利要求4所述一種權種要求1所述的黃曲霉毒素M1金標快速檢測卡的制備方法，其特征在于所述黃曲霉毒素M1-蛋白偶聯物的制備步驟中，所述100μlDMF-水中DMF與水的體積比為6：9。?