[發明專利]一種殺鞘翅目害蟲的蘇云金芽孢桿菌工程菌及制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310316560.3
• 申請日: 2013-07-25
• 公開（公告）號: CN103396977A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發明（設計）人: 高梅影;余亞軍;劉朋明;吳丹丹;吳燕
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;A01N63/02;A01P7/04;C12R1/07
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明涉及微生物農藥技術領域，具體涉及一株蘇云金芽孢桿菌，更具體涉及一種殺鞘翅目害蟲的蘇云金芽孢桿菌工程菌的制備方法，同時還涉及一種殺鞘翅目害蟲的蘇云金芽孢桿菌工程菌在殺蟲劑中的用途。?

背景技術

鞘翅目是昆蟲綱中最大的一個目，鞘翅目害蟲對農林生產的危害僅次于鱗翅目害蟲。鞘翅目害蟲廣泛分布于世界各地(Biodiversity?of?Coleoptera/Insect?biodiversity:science?and?society，West?Sussex:Blackwell?Publishing，2009，265-301)。比較常見的如馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa?decemlineata）、玉米根葉甲（Diabrotica?virgifera）、猿葉蟲（Phaedon?brassicae?Baly）、銅綠麗金龜子（Anomala?corpulenta）、柳藍葉甲（Plagiodera?versicolora）、榆藍葉甲（Pyrrhalta?aenescens）等。這些害蟲對馬鈴薯、玉米、蔬菜、農作物、林木等造成嚴重危害(新疆農業科學,2012,48(12):2217-2222；植物檢疫,1997,11(2):101-103；植保技術與推廣,1995,(5):29-30；Biological?Control,1995,5(2):290-296;東北林業大學學報,2003,31(3):65-66)。目前對鞘翅目害蟲的防治大多只能依靠化學農藥，化學農藥殺蟲特異性差，同時造成環境污染，對人畜具有危害，因此殺蟲特異性好、環境友好、對人畜安全的生物殺蟲劑越來越受到人們的重視。蘇云金芽孢桿菌對鱗翅目害蟲的防治是最成功、最廣泛的生物防治典型(Microbiology?and?Molecular?Biology?Reviews,1998，62(3):775-)，但殺鞘翅目害蟲的Bt殺蟲劑應用較少，這與殺鞘翅目昆蟲的Bt菌株及基因資源較少、殺蟲晶體蛋白毒性較低等有關。因此，不斷挖掘新的特異性Bt菌種及基因資源，通過基因工程的手段提高殺蟲蛋白產量及毒性，構建出對鞘翅目有高效殺蟲活性的Bt菌株并運用其生產新型殺蟲劑具有現實意義和緊迫性。?

在殺鞘翅目Bt菌株的篩選和基因資源發掘方面，文獻“Bacillus?thuringiensis?var.tenebrionis,a?new?pathotype?effective?against?larvae?of?Coleoptera”報道了第一株對鞘翅目害蟲有特異殺蟲活性的Bt菌株（Zeitschrift?Fur?Angewandte?Entomologie-Journal?of?Applied?Entomology,1983,96(5):500-508）。文獻“A?new?strain?of?Bacillus?thuringiensis?with?activity?against?coleopteran?insects”和“Nucleotide?sequence?and?deduced?amino?acid?sequence?of?a?coleopteran-active?delta-endotoxin?gene?from?Bacillus?thuringiensis?subsp.san?diego”報道了第二株對鞘翅目昆蟲有毒性的Bt菌株并克隆了其殺蟲晶體蛋白編碼基因cry3Aa?（Bio-Technology,1986，4(4):305-308；Gene,1987，57(1):37-46）。以上兩種Bt菌株都對危害嚴重的馬鈴薯甲蟲有高效的殺蟲活性。文獻“A?unique?isolate?of?Bacillus?thuringiensis?serovar?japonensis?with?a?high?larvicidal?activity?specific?for?scarabaeid?beetles”及“Insecticidal?spectrum?of?a?novel?isolate?of?Bacillus?thuringiensis?serovar?japonensis”報道了對金龜子幼蟲蠐螬有活性的Bt菌株，此菌株對多種金龜子幼蟲有高效毒殺活性，但對鱗翅目、雙翅目、直翅目和鞘翅目（金花甲科）害蟲無活性，表現了高度的特異性(Letters?in?Applied?Microbiology,1992，14(2):54-57；Biological?Control,1992，2(2):138-142)；此后，文獻“Characterization?of?larvicidal?toxin?protein?from?Bacillus?thuringiensis?serovar?japonensis?strain?Buibui?specific?for?scarabaeid?beetles”和“Cloning,heterologous?expression,and?localization?of?a?novel?crystal?protein?gene?from?Bacillus?thuringiensis?serovar?japonensis?strain?Buibui?toxic?to?scarabaeid?insects”報道了該菌株的殺蟲活性物質為130KD的Cry蛋白，相應的基因為cry8Ca1(Journal?of?Applied?Bacteriology,1994，76(4):307-313；Current?Microbiology,1994,28(1):15-19)。三十年來，陸續有不同的對鞘翅目害蟲有活性的Bt菌株和基因被分離和克隆。目前，已知的對鞘翅目害蟲具有殺蟲活性的Bt主要有擬步甲亞種（Bt?subsp.tenebrionis）、圣地亞哥亞種（Bt?subsp.sandiego）、莫里遜亞種（Bt?subsp.morrisoni）、多窩亞種（Bt?subsp.tolworthi）、熊本亞種（Bt?subsp.kumanotoensis）、庫斯塔亞種（Bt?subsp.kurstaki）、蠟螟亞種（Bt?subsp.galleriae）、蘇云金亞種（Bt?subsp.thuringiensis）、日本亞種（Bt?subsp.japonensis）和中華亞種（Bt?subsp.chinensis）等。文獻“幾個對鞘翅目昆蟲有毒性的蘇云金桿菌菌株”研究了Bt菌株C-001～006和ES-01對銅綠麗金龜(Anomala?corpilenta?Motschulsky)、黃粉蟲(Tenebrio?molitor)的毒性(昆蟲知識,1991，(3):151-152)；“殺鞘翅目蘇云金芽孢桿菌新菌株及殺蟲劑的研究”和“殺鞘翅目幼蟲Bt菌株YM-03的δ-內毒素基因定位”報道了Bt菌株YM-03對馬鈴薯甲蟲和柳藍葉甲等鞘翅目昆蟲的殺蟲活性及殺蟲基因的定位(微生物學報,1999,39(6):515-520；微生物學雜志,2000,20(1):18-19)，YM-03中的殺蟲蛋白基因已被克隆并被正式命名為cry3Aa8(accession?number:AY572010)。“一株對金龜子類幼蟲具有殺蟲活性的蘇云金桿菌新分離株”報道了對銅綠麗金龜(Anomala?corpilenta?Motschulsky)與黃褐麗金龜(Anomala?exoleta?Faldermann)幼蟲有毒殺活性的Bt菌株HBF-1(中國生物防治,2000,16(2):74-77)。“蘇云金芽孢桿菌cry基因PCR-RFLP鑒定體系的建立”、“蘇云金芽孢桿菌cry1Ie1和cry8基因的研究”及“Improving?toxicity?of?Bacillus?thuringiensis?strain?contains?the?cry8Ca?gene?specific?to?Anomala?corpulenta?larvae”完善了PCR-RFLP鑒定體系，并利用此技術從Bt菌株HBF-1中克隆到了一個與cry8Ca1僅一個密碼子（一個氨基酸）差異的殺蟲蛋白基因cry8Ca2?(中國農業科學,1998,31(3):11-14；中國農業科學院生物技術研究所博士后研究工作報告,2003,23-46；Current?Microbiology,2007，55(6):492-496)。文獻“Bt殺蟲晶體蛋白的研究概述”總結了殺鞘翅目害蟲的殺蟲晶體蛋白基因有cry1B,cry1I,cry3A,cry3B,cry3C,cry7A,cry8A,cry8B,cry18A等(黑龍江農業科學,2004,5:37-39)。文獻“Insecticidal?activity?of?Bacillus?thuringiensis?crystal?proteins”總結了殺蟲Bt晶體蛋白的殺蟲活性，其中30種Cry蛋白（二級分類）對鞘翅目害蟲有殺蟲活性，除Cry8類蛋白（7種）外，其余種類數目均較少（≤3種），就殺蟲譜而言，目前已發現的對鞘翅目害蟲有活性的Cry蛋白對多種鞘翅目害蟲有活性，其中Cry3Aa類蛋白殺蟲譜最廣，甚至對半翅目（Hemiptera）和膜翅目（Hymenoptera）害蟲都有活性(Journal?of?Invertebrate?Pathology,2009,101(1):1-16)。文獻“對鞘翅目昆蟲高毒力蘇云金芽孢桿菌的篩選鑒定”總結了不同的鞘翅目毒性Cry蛋白及其殺蟲譜(黑龍江大學生命科學學院，2012)。“蠐螬高毒力蘇云金芽孢桿菌研究”（現代商貿工業，2010，9：353-355）及“蘇云金芽孢桿菌對松材線蟲的殺線活性”（中國生物防治，2010，26(1)：85-89）等分別從眾多的蘇云金芽孢桿菌菌株中篩選到了對煙草甲、美國白蛾、甜菜夜蛾、蠐螬、線蟲等害蟲的高效特異性菌株。?