[發(fā)明專利]一種乳或乳制品中牛乳血清白蛋白定量檢測試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310315153.0
• 申請日: 2013-07-24
• 公開（公告）號: CN104345107A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發(fā)明（設計）人: 任一平;賴世云;張京順
• 申請（專利權）人: 上海科倍斯生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/06
• 代理公司: 上海翼勝專利商標事務所(普通合伙) 31218
• 代理人: 施春花;翟羽

技術領域

本發(fā)明涉及一種可測定乳或乳制品中熱變性和非變性的常量或微量的牛乳血清白蛋白定量的檢測試劑盒。

背景技術

牛血清白蛋白（Bovine?serum?albuminn，BSA)是牛血清中的一種主要的球蛋白之一，也是乳清蛋白的成分之一，又稱第五組分(Fraction?V)，簡稱為BSA，包含583個氨基酸殘基，分子量為66.43kDa，25℃下水中等電點為4.7，主要存在于牛血清中，約占牛血清中總蛋白的52-62%；此外，在牛奶中也含有少量的血清白蛋白，約為牛奶中總蛋白的1.4%。

據(jù)報道，牛血清白蛋白最主要的生理作用為維持人體血液中的滲透壓和pH值平衡，而Karjalainen（1992）等人則發(fā)現(xiàn)嬰幼兒從牛奶中攝入的牛血清白蛋白與胰島素依賴性糖尿病（IDDM）的引發(fā)有直接的關系，其研究表明，在母乳哺喂六個月后再喂含一定量牛血清白蛋白的乳制品可大大減少嬰兒引發(fā)胰島素依賴性糖尿病的可能性。因此，研究乳及乳制品中牛血清白蛋白的量對嬰幼兒的健康成長有著重要的作用。

目前國內(nèi)外用于牛乳血清白蛋白檢測最主要的方法為ELISA法，該法靈敏度高、特異性強，但對操作人員要求高，重現(xiàn)性較差，定量結果不準確，可滿足樣品的初篩，而準確定量尚有缺陷。經(jīng)查詢，至今為止還未發(fā)現(xiàn)應用同位素內(nèi)標肽稀釋法，結合LC-ESI-MS/MS測定乳與乳制品中熱變性和非變性牛乳血清白蛋白的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的第一個技術問題是，提供一種應用同位素標記內(nèi)標肽稀釋法，結合LC-ESI-MS/MS可定量測定不同乳及乳制品中牛乳血清白蛋白含量的試劑盒。

本發(fā)明所要解決的第二個技術問題是，提供一種應用同位素標記內(nèi)標肽稀釋法，結合LC-ESI-MS/MS定量檢測牛乳血清白蛋白的方法。

為了解決上述第一個技術問題，本發(fā)明提供了一種牛乳血清白蛋白定量檢測試劑盒，所述試劑盒包括牛乳血清白蛋白特異肽，同位素標記牛乳血清白蛋白特異肽和同位素標記牛乳血清白蛋白內(nèi)標；所述牛乳血清白蛋白特異肽的氨基酸序列為LVNELTEFAK（SEQ?ID?NO.1）；所述同位素標記牛乳血清白蛋白特異肽的氨基酸序列為LV^*NEL^*TEFAK（SEQ?ID?NO.2，其中同位素標記*符號未顯示），其中V^*和L^*為碳氮全同位素標記的氨基酸；所述同位素標記牛乳血清白蛋白內(nèi)標的氨基酸序列為QCPFDEHVKLV^*NEL^*TEFAKTCVADESHAGC（SEQ?ID?NO.3，其中同位素標記符號*未顯示出），其中V^*和L^*為碳氮全同位素標記的氨基酸。

作為一個優(yōu)選方案，所述試劑盒還包括氯化鈣（CaCl₂），碳酸氫銨（NH₄HCO₃），二硫蘇糖醇（DTT），碘代乙酰胺（IAA），胰蛋白酶和甲酸。

作為一個優(yōu)選方案，所述氯化鈣的使用濃度是100mmol/L，碳酸氫銨的使用溶度是50mmol/L，二硫蘇糖醇的使用濃度是500mmol/L，碘代乙酰胺的使用濃度是500mmol/L，胰蛋白酶的使用濃度是200μg/mL。

為了解決上述第二個技術問題，本發(fā)明提供了一種牛乳血清白蛋白定量檢測方法，包括以下步驟：

（1）樣品前處理以釋放特異肽：將待測樣品用溫水溶解，加入同位素標記牛乳血清白蛋白內(nèi)標和碳酸氫銨溶液混勻，加入二硫蘇糖醇溶液，碘代乙酰胺溶液，氯化鈣溶液和胰蛋白酶溶液，37℃恒溫過夜酶解，次日取出加入甲酸，最后加水定容，然后將所得溶液過0.22μm微孔濾膜后進樣分析，所述同位素標記牛乳鐵蛋白內(nèi)標的氨基酸序列為QCPFDEHVKLV^*NEL^*TEFAKTCVADESHAGC，其中V^*和L^*為碳氮全同位素標記的氨基酸；

（2）步驟（1）所得樣品進行液相色譜分離；

（3）樣品經(jīng)步驟（2）色譜分離后進行質譜檢測，所用牛乳血清白蛋白特異肽的氨基酸序列為LVNELTEFAK；所用同位素標記牛乳血清白蛋白特異肽的氨基酸序列為LV^*NEL^*TEFAK，其中V^*和L^*為碳氮全同位素標記的氨基酸。