[發明專利]利用薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊的試劑盒和方法

有效

• 申請號: 201310311469.2
• 申請日: 2013-07-23
• 公開（公告）號: CN103361318A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 王瑞龍;曾任森;鄭子豪;任勇;張暉;宋圓圓;蘇貽娟
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02;A01N63/00;A01P13/00;C12R1/94
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉

技術領域

本發明屬于外來入侵有害生物綜合防控的技術領域，具體涉及一種利用薇甘菊萎蔫病毒（Mikania?micrantha?wilt?virus，MMWV）生物控制薇甘菊的試劑盒和方法。

背景技術

薇甘菊（Mikania?micrantha?H.B.K.）是菊科（Compositae）假澤蘭屬（Mikania?Willd）多年生藤本植物。薇甘菊生物入侵對華南地區的生態環境造成嚴重危害，薇甘菊的控制問題已經成為世界性的難題。控制技術有人工及機械清除、除草劑化學防治、利用天敵和致病病原菌控制的生物防治等，生物防治是控制有害生物入侵的有效方法。其中人工清除勞動強度大，效率低、成本高，難以根除；化學防治易造成環境污染，生物防治是控制外來入侵種最有前景的方法。目前發現的薇甘菊萎蔫病毒（Mikania?micrantha?wilt?virus）可引起薇甘菊葉片萎蔫、節間矮化，頂枯等癥狀，嚴重抑制薇甘菊的生長。

發明內容

為了克服上述現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一株以薇甘菊病株為篩選對象，分離得到具有強的可使薇甘菊致病的薇甘菊萎蔫病毒（Mikania?micrantha?wilt?virus），為薇甘菊生物入侵的防治奠定基礎。

本發明的另一目的在于提供一種利用上述薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊的試劑盒。該試劑盒適用于控制薇甘菊入侵的灌叢、人工林、天然次生林等地，能有效的控制薇甘菊的入侵。

本發明的另一目的在于提供所述利用薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊的試劑盒的使用方法。

本發明的再一目的在于提供一種繁殖和提純薇甘菊萎蔫病毒的方法。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種薇甘菊萎蔫病毒，其命名為蠶豆病毒屬（Fabavirus）薇甘菊萎蔫病毒MMWV-5（Mikania?micrantha?wilt?virus，MMWV-5），保藏于中國典型培養物保藏中心（CCTCC），地址：中國.武漢.武漢大學，保藏號為CCTCC?NO：V201321，保藏時間為2013年7月10日。

所述的薇甘菊萎蔫病毒的繁殖，包括以下步驟：

（1）將薇甘菊萎蔫病毒毒原，利用磷酸緩沖液（0.01mol/L，pH7.0）稀釋后，在25-27℃，常規汁液摩擦接種，當蠶豆幼苗具有3～4片真葉時，在頂部的第1片和第2片真葉上均勻地灑一層石英砂，用齊頭毛筆蘸取接種液在接種葉上輕輕摩擦，隨后用蒸餾水沖洗掉葉片上殘留的物質；薇甘菊萎蔫病毒在蠶豆上繁殖，7-10d后采取病葉；

（2）按病葉加入2倍體積（w/v）預冷的0.5mol/L的磷酸鉀鹽緩沖液（KPB，pH7.5，內含體積分數為0.1％巰基乙醇，質量分數為0.01％Triton?X-100，質量分數為2.5%蔗糖），勻漿2min，4℃靜置1h，8000g離心20min；

（3）取上清液，加入PEG-6000、NaCl和Triton?X-100，使其濃度分別達到質量分數為6%、0.1mol/L、質量分數為2.5%，4℃下攪拌6h，8500g離心5min；

（4）取沉淀，用0.01mol/L?KPB（pH7.5，內含質量份數為0.01％Triton?X-100)，充分懸浮，7000g離心10min；

（5）吸取上清液置于離心管，沉淀再懸浮離心，重復2次，合并上清液；

（6）上清液78000g超速離心2h；

（7）沉淀用0.01mol/L?KPB（pH7.5）懸浮，懸浮液低速離心后取上清液，得到提純病毒液。

一種利用薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊的試劑盒，包含上述的薇甘菊萎蔫病毒毒原。

所述的利用薇甘菊萎蔫病毒生物控制薇甘菊試劑盒，優選為由以下組分組成：

1）薇甘菊萎蔫病毒毒原（-20℃保存）；

2）0.5mol/L的磷酸鉀鹽緩沖液(KPB，pH7.5，內含體積分數為0.1％巰基乙醇，質量分數為0.01％Triton?X-100，質量分數為2.5%蔗糖)；

3）聚乙二醇（PEG-6000）；

4）氯化鈉（NaCl）；

5）Triton?X-100；

6）0.01mol/L?KPB（pH7.5，內含質量分數為0.01％Triton?X-100)；

7）金剛砂（400～600目）；

8）0.01mol/L磷酸緩沖液（pH7.0）。