[發(fā)明專(zhuān)利]一種提高變色栓菌（Trametes versicolor）漆酶產(chǎn)量的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310306641.5
• 申請(qǐng)日: 2013-07-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103409381A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉春朝;王鋒;郭晨
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/02
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/02;C12R1/645
• 代理公司: 北京品源專(zhuān)利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種提高變色栓菌漆酶產(chǎn)量的方法。?

背景技術(shù)

氧化還原酶主導(dǎo)的酶催化氧化技術(shù)在工業(yè)上有著廣泛的應(yīng)用，目前已有應(yīng)用的領(lǐng)域包括紙漿和造紙、紡織和食品工業(yè)等。其中，漆酶（苯二醇∶氧氧化還原酶，EC?l.10.3.2）是最具有應(yīng)用前景的氧化還原酶之一，主要用于有機(jī)合成、環(huán)境污染物的降解和染料脫色、生物檢測(cè)和電化學(xué)分析、造紙工業(yè)中的紙漿漂白和廢水處理、纖維原料的降解等。?

真菌漆酶是漆酶的主要來(lái)源，作為此類(lèi)真菌的代表性菌株—變色栓菌（Trametes?versicolor）被認(rèn)為是用于生產(chǎn)漆酶的優(yōu)良菌株之一，而且該真菌漆酶已經(jīng)被一些國(guó)際知名公司（如Sigma）商品化，但是由于該產(chǎn)品的價(jià)格太高，尚不能滿足規(guī)模化應(yīng)用的要求。漆酶發(fā)酵表達(dá)水平低是造成漆酶生產(chǎn)和應(yīng)用成本高的原因之一，因此，提高漆酶的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本成為漆酶生產(chǎn)研究的主要目的。目前采用的策略包括漆酶高產(chǎn)菌株的篩選、漆酶的發(fā)酵工藝及其合成調(diào)控、漆酶基因的克隆和異源表達(dá)等。然而，常規(guī)的漆酶高產(chǎn)菌種的選育方法通常都是工作量大，效率低，獲得高產(chǎn)菌株難度大；通過(guò)對(duì)漆酶發(fā)酵培養(yǎng)基的組成、pH、碳氮比、溫度、通氣量和誘導(dǎo)劑用量的優(yōu)化，能夠提高真菌漆酶的表達(dá)水平，但其提高幅度是非常有限的。雖然，漆酶已通過(guò)酵母、絲狀真菌等成熟表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了表達(dá)，得到了一些高產(chǎn)量的工程菌株，但其產(chǎn)量與產(chǎn)漆酶真菌相比并無(wú)優(yōu)勢(shì)，仍需進(jìn)一步提高才能滿足工業(yè)上的需要。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種提高變色栓菌漆酶產(chǎn)量的方法。該方法能夠大幅提高變色栓菌的漆酶產(chǎn)量；并且該方法操作簡(jiǎn)單，易于放大生產(chǎn)，適于大規(guī)模漆酶發(fā)酵，從而降低漆酶生產(chǎn)成本，滿足規(guī)模化應(yīng)用的要求。?

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：?

一種提高變色栓菌漆酶產(chǎn)量的方法，包括：在變色栓菌漆酶發(fā)酵過(guò)程的菌絲體生長(zhǎng)階段，向發(fā)酵液中添加法尼醇，并繼續(xù)發(fā)酵以產(chǎn)生漆酶。?

優(yōu)選地，所述法尼醇添加的終濃度為10～100μM，例如10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM等，進(jìn)一步優(yōu)選為30～80μM，更進(jìn)一步優(yōu)選為40～60μM。?

優(yōu)選地，以法尼醇溶液的形式向發(fā)酵液中添加法尼醇，所述法尼醇溶液的配制溶劑為乙醇、正丙醇、異丙醇和正丁醇中的一種或至少兩種的混合，進(jìn)一步優(yōu)選為乙醇或異丙醇。所述混合典型但非限定性的實(shí)例有：乙醇和正丙醇的混合，乙醇和異丙醇的混合，乙醇和正丁醇的混合，正丙醇和異丙醇的混合，正丙醇和正丁醇的混合，異丙醇和正丁醇的混合，乙醇、正丙醇和異丙醇的混合等。法尼醇易溶于有機(jī)溶劑，上述溶劑是配制法尼醇溶液的良好溶劑，并且對(duì)變色栓菌的菌絲體生長(zhǎng)和漆酶合成無(wú)副作用。?

作為優(yōu)選方案，所述方法具體包括如下步驟：?

（1）將預(yù)培養(yǎng)的變色栓菌菌絲體接種到漆酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；?

（2）在所述發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程的菌絲體生長(zhǎng)階段，向發(fā)酵液中添加法尼醇溶液；?

（3）在菌絲體生長(zhǎng)結(jié)束并進(jìn)入漆酶合成階段后，選擇適于漆酶表達(dá)和分泌的pH、攪拌速率和通氣量，并繼續(xù)培養(yǎng)以產(chǎn)生漆酶；?

（4）培養(yǎng)至發(fā)酵液中漆酶活力達(dá)到峰值時(shí)，結(jié)束發(fā)酵并收集發(fā)酵液。?

優(yōu)選地，所述步驟（1）中所述變色栓菌菌絲體預(yù)培養(yǎng)方法、發(fā)酵培養(yǎng)基的組成采用已有文獻(xiàn)報(bào)道的方法（Wang等人,Ultrasound-intensified?laccase?production?from?Trametes?versicolor,Ultrasonics?Sonochemistry,2013,20:118–124），培養(yǎng)溫度26℃。?

優(yōu)選地，所述步驟（1）中發(fā)酵培養(yǎng)的具體條件：?

pH為4.1～6.0，例如4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0，優(yōu)選為4.5～5.5；?

攪拌速率為200～400rpm，例如200rpm、220rpm、240rpm、250rpm、260rpm、280rpm、300rpm、320rpm、340rpm、350rpm、360rpm、380rpm、400rpm，優(yōu)選為250～350rpm；?