[發明專利]一種快速檢測番木瓜環斑病毒膠體金免疫試紙條

有效

• 申請號: 201310305087.9
• 申請日: 2013-07-20
• 公開（公告）號: CN103412121A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 陳啟建;葉通;歐陽明安;林詩發;譚慶偉
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明屬于植物病害病原診斷技術領域，涉及一種植物病毒的快速診斷方法，特別是涉及一種檢測番木瓜環斑病毒免疫膠體金試紙條的制備與應用。?

背景技術

番木瓜環斑病毒（Papaya?ringspot?virus，PRSV）是馬鈴薯Y病毒屬的重要成員，是引起番木瓜病毒病的重要病毒之一。20世紀40年代美國首次報道了此病毒。我國于20世紀50年代初引進了番木瓜進行種植生產，1959年便在番木瓜上發現了該病毒，1962年后PRSV在我國廣泛流行。番木瓜植株一旦受到PRSV的侵染，死亡率可高達90%，使番木瓜生產受到毀滅性的打擊。2000年海南省種植的上千畝番木瓜因PRSV的侵染而幾乎絕收。由于PRSV的嚴重為害，我國多個地區番木瓜生產被迫采取春植秋砍的種植方式，即春天的時候將番木瓜幼苗種下，而在秋天的時候將樹砍掉，使多年生的番木瓜人為變成一年生的植物種植，不但給生產上帶來了很大的麻煩，同時也造成了嚴重的經濟損失。田間的早期診斷是植物病毒病有效防控的關鍵環節。目前，用于番木瓜環斑病毒病病原診斷的方法主要有傳統生物學方法、酶聯免疫吸附測定法（ELISA）和分子生物學方法。傳統生物學方法鑒定病毒雖然操作簡單，無需特殊儀器設備，但存在以下不足之處：（1）需要采用一系列的鑒別寄主進行鑒定，且非專業人員常面臨著對出現的癥狀難以準確判斷的問題。（2）在實際鑒定中，往往多種病毒復合侵染寄主，使癥狀產生極大的變化，不易判斷；（3）鑒定速度慢，周期長。接種后鑒別寄主產生癥狀所需的時間一般在3天以上，有的甚至長達20天以上；（4）鑒定結果易受季節和周邊環境的影響，且需要一個相對獨立的空間，避免病毒的交叉傳染；（5）有些病毒尚無合適的鑒別寄主，無法采用傳統生物學方法進行鑒定。酶聯免疫吸附測定法和分子生物學方法檢測病毒雖具有檢測特異性強、靈敏度高、檢測時間較傳統生物學方法短的優點，但至少也存在以下不足：（1）這兩種方法都需要特殊的儀器設備，且操作人員一般要經過專門的培訓，使得這兩種檢測病毒的方法只能在實驗室內完成，不利于在基層單位進行推廣和使用；（2）與傳統生物學方法相比，檢測時間雖有很大的縮短，但所需時間至少也要數小時，仍不適用于田間現場的快速檢測；（3）檢測所需的成本較高，特別是分子生物學檢測方法，需要使用昂貴的試劑。膠體金免疫試紙條是采用膠體金標記技術研制而成的，膠體金是氯金酸（HAuCl₄）?的水溶膠，氯金酸在還原劑的作用下聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩定的膠體狀態。膠體金標記技術就是通過調節還原劑的加入量，制備出不同大小和顏色的膠體金顆粒，這些膠體金顆粒對蛋白有很強的吸附性，能夠與免疫球蛋白非共價鍵結合形成肉眼可以看到紅或粉紅的顏色。膠體金免疫試紙條檢測法的優點在于無需借助實驗室設備和專業技術人員，只需要取少量的植物汁液滴在試紙條上的樣品墊上，便可在十幾分鐘甚至幾分鐘內得到檢測結果，具有安全簡便、無放射性污染、靈敏度高、結果準確、成本低等特點，適合對植物病毒的現場檢測。?

發明內容

本發明旨在提供一種快速檢測番木瓜環斑病毒的膠體金免疫層析試紙條的制備方法，解決目前田間現場快速檢測番木瓜環斑病毒尚缺少有效手段問題。本發明制備的試紙條具有操作簡單、檢測快速、結果準確可靠、成本低廉、無需借助特殊的儀器設備，適用于田間現場檢測等特點，可用于田間病株的早期診斷，為番木瓜環斑病毒病的防治提供有效的預警，提高番木瓜環斑病毒病的防治效率，減少由其造成的經濟損失。

???????一種檢測番木瓜環斑病毒免疫膠體金試紙條，其特征在于制備方法包括下述步驟：

1)????????PRSV的提純：將PRSV-Vb株系摩擦接種于系統感染寄主西葫蘆上，以出現典型癥狀的西葫蘆葉片為提純PRSV的材料進行提純，得提純的番木瓜環斑病毒；

2)????????多克隆抗體的制備：以步驟1）提純的PRSV為抗原，弗氏佐劑為乳化劑，按常規方法免疫新西蘭大白兔，制備抗PRSV的多克隆抗體；

3)????????多克隆抗體純化：對步驟2)所制備的抗PRSV多克隆抗體進行純化；

4)????????膠體金溶液的制備：按100?mL?0.01%?w/v的四氯金酸溶液用1.5?mL–3?mL的1%?w/v檸檬酸鈉溶液還原的比例制備膠體金溶液，溶液攪拌煮沸15?min，用0.22?μm微孔濾膜過濾，收集濾液于4℃條件下保存；