[發明專利]一種具備鈣通道抑制功能的動物活性肽的鑒定方法

無效

• 申請號: 201310302457.3
• 申請日: 2013-07-19
• 公開（公告）號: CN104062433A
• 公開（公告）日: 2014-09-24
• 發明（設計）人: 鄧梅春;羅旋
• 申請（專利權）人: 長沙沁才生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種具備哺乳動物N-型鈣通道抑制功能的活性多肽─蜘蛛抑痛肽-XVI（SPAP-XVI）的鑒定方法。

背景技術

鈣離子作為細胞內重要的第二信使， 對于信號傳導、興奮－收縮藕聯、分泌、突觸傳遞、基因表達調控具有非常重要的作用。電壓門控鈣通道廣泛存在于機體的不同類型組織細胞中，參與神經、肌肉、分泌、生殖等系統的生理過程。根據電壓門控鈣通道的電生理和藥理學特征，可將電壓門控鈣通道分為低閾值(LVA)和高閾值(HVA)兩大類。其中低閾值鈣通道主要包括T-型鈣通道，高閾值鈣通道主要包括有N-型、L-型、P/Q-型和R-型四類。其中N-型鈣通道僅發現存在于神經組織中，主要觸發遞質的釋放，與疼痛的傳遞密切相關。蜘蛛產生各種作用于神經系統的神經毒素，其神經毒素根據它們的化學結構分為蛋白多肽類神經毒素和多胺類神經毒素。其中蜘蛛多肽神經毒素最重要，蜘蛛多肽類神經毒素根據它們的功能和分子特征可分為兩種類型:第一種是低分子量多肽類，它們能與興奮性細胞膜上的陽離子通道相互作用；第二種是高分子量多肽類，它們與突觸前膜的受體組分及增強神經介質的分泌作用密切相關。蜘蛛毒液已成為神經毒素的一個重要新來源，而且蜘蛛毒液中特異性藥物和毒素分子也是我們尋找農業殺蟲劑的較好模式分子。

SPAP-XVI的分子量約為4437.4 Da，經序列測定，該多肽的一級結構由39個氨基酸殘基組成，其中含6個半胱氨酸并形成三對二硫鍵。

發明內容

本發明旨在于提供一種從蜘蛛毒液中鑒定哺乳動物N-型鈣通道抑制劑蜘蛛抑痛肽-XVI（SPAP-XVI）的方法。其特征在于：

（1）大鼠輸精管實驗研究SPAP-XVI 的組織水平生物學活性：大鼠處死后立即取出長約2厘米的輸精管，并置于預先用95% O₂/5% CO₂ 飽和的克氏液，輕柔的擠出輸精管的內容物。將輸精管的兩端分別與34oC恒溫的浴槽的底部和換能器相連接，立即將標本置于浴槽中，通過分布于浴槽兩端的電極向輸精管施加脈沖電場刺激 （波寬: 0.14 ms，強度： 100 V，周期：15 s）誘導輸精管收縮；平衡30 min 后進行SPAP-XVI的藥理學試驗；

（2）膜片鉗電生理活性實驗檢測SPAP-XVI對電壓門控鈣通道的影響：

①急性分離和原代培養大鼠背根神經節細胞用于膜片鉗電生理活性實驗；SD大白鼠處死后，用剪子迅速取出脊椎，再沿與肋骨平面垂直的方向將椎管剪開，并浸泡在盛有少量細胞培養液的燒杯中；用鑷子撕破附在椎管內壁上的一層黏膜，暴露位于椎管和肋骨的交匯處的背根神經纖維。在胸腰椎段，可挑選16個左右并置入盛有2 mL培養液的培養皿中；在解剖顯微鏡下，用維娜斯剪和尖頭鑷子分離出神經節。剝離包在節外的絮狀物和軸索后，放入盛有約0.5 mL培養液的培養皿中。用吸管吸去液體，將分離好的所有神經節剪碎。剪碎之后，轉入消化液，在34℃、震蕩頻率110 rpm的環境中進行酶解消化反應20 min；期間每隔10 min取出用移液槍吸打數次；向消化液中加入酶的抑制劑，終止酶解處理過程；無菌操作將消化得到的細胞液轉入離心管中進行離心（800 rpm、5 min），去上清，加入8 mL含10%小牛血清的長期培養液； 重懸細胞后分成3～4皿，放入培養箱（5%CO₂、95%空氣）中，37℃培養3～4 h貼壁；

②膜片鉗電生理活性實驗：膜片鉗實驗要在室溫條件下進行，采用全細胞膜片鉗技術。挑選質膜光滑可見、胞質均勻的DRG細胞作為實驗細胞；電流記錄通過全細胞膜片鉗技術利用放大器EPC9在電腦上進行。玻璃電極管為硼硅酸鹽玻璃毛細管。玻璃電極兩步拉制而成，經拋光儀拋光后電極尖端直徑約為3 mm，充灌電極液后電極電阻為1-3MΩ；實驗細胞形成全細胞記錄模式后穩定4～6 min；記錄電流經EPC-9放大器10 kHz 濾波過濾。線性漏電流和電容電流用p/4程序予以刪除, 數據和圖形用pulsefit + pulse 8.0 軟件采集分析；實驗結果用Sigmaplot9.0軟件進行分析。

本發明所述的SPAP-XVI的化學結構式如圖1所示，其中C為半胱氨酸，I為異亮氨酸，G為甘氨酸，E為谷氨酸，V為纈氨酸，P為脯氨酸，D為天冬氨酸，N為天冬酰胺，R為精氨酸，S為絲氨酸，L為亮氨酸，K為賴氨酸，T為蘇氨酸，H為組氨酸，W為色氨酸，Y為酪氨酸。

附圖說明

圖1是蜘蛛抑痛肽-XVI的化學結構。