[發(fā)明專利]一種具備鈣通道抑制功能的動物活性肽的鑒定方法無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201310302457.3 | 申請日： | 2013-07-19 |
| 公開（公告）號： | CN104062433A | 公開（公告）日： | 2014-09-24 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 鄧梅春;羅旋 | 申請（專利權(quán)）人： | 長沙沁才生物科技有限公司 |
| 主分類號： | G01N33/68 | 分類號： | G01N33/68 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 410000 湖南*** | 國省代碼： | 湖南;43 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 具備 通道 抑制 功能 動物 活性 鑒定 方法 | ||
1.本發(fā)明旨在于提供一種從蜘蛛毒液中鑒定哺乳動物N-型鈣通道抑制劑蜘蛛抑痛肽-XVI（SPAP-XVI）的方法，其特征在于：
（1）大鼠輸精管實驗研究SPAP-XVI 的組織水平生物學(xué)活性：大鼠處死后立即取出長約2厘米的輸精管，并置于預(yù)先用95% O2/5% CO2 飽和的克氏液，輕柔的擠出輸精管的內(nèi)容物；將輸精管的兩端分別與34oC恒溫的浴槽的底部和換能器相連接，立即將標(biāo)本置于浴槽中，通過分布于浴槽兩端的電極向輸精管施加脈沖電場刺激（波寬:0.14 ms，強度：100 V，周期：15 s）誘導(dǎo)輸精管收縮；平衡30 min 后進行SPAP-XVI的藥理學(xué)試驗；
（2）膜片鉗電生理活性實驗檢測SPAP-XVI對電壓門控鈣通道的影響：
①急性分離和原代培養(yǎng)大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞用于膜片鉗電生理活性實驗：SD大白鼠處死后，用剪子迅速取出脊椎，再沿與肋骨平面垂直的方向?qū)⒆倒芗糸_，并浸泡在盛有少量細胞培養(yǎng)液的燒杯中；用鑷子撕破附在椎管內(nèi)壁上的一層黏膜，暴露位于椎管和肋骨的交匯處的背根神經(jīng)纖維；在胸腰椎段，可挑選16個左右并置入盛有2 mL培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中；在解剖顯微鏡下，用維娜斯剪和尖頭鑷子分離出神經(jīng)節(jié)；剝離包在節(jié)外的絮狀物和軸索后，放入盛有約0.5 mL培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中；用吸管吸去液體，將分離好的所有神經(jīng)節(jié)剪碎；剪碎之后，轉(zhuǎn)入消化液，在34℃、震蕩頻率110 rpm的環(huán)境中進行酶解消化反應(yīng)20 min；期間每隔10 min取出用移液槍吸打數(shù)次；向消化液中加入酶的抑制劑，終止酶解處理過程；無菌操作將消化得到的細胞液轉(zhuǎn)入離心管中進行離心（800 rpm、5 min），去上清，加入8 mL含10%小牛血清的長期培養(yǎng)液；重懸細胞后分成3～4皿，放入培養(yǎng)箱（5%CO2、95%空氣）中，37℃培養(yǎng)3～4 h貼壁；
②膜片鉗電生理活性實驗：膜片鉗實驗要在室溫條件下進行，采用全細胞膜片鉗技術(shù)；挑選質(zhì)膜光滑可見、胞質(zhì)均勻的DRG細胞作為實驗細胞；電流記錄通過全細胞膜片鉗技術(shù)利用放大器EPC9在電腦上進行；玻璃電極管為硼硅酸鹽玻璃毛細管；玻璃電極兩步拉制而成，經(jīng)拋光儀拋光后電極尖端直徑約為3 mm，充灌電極液后電極電阻為1-3 MΩ；實驗細胞形成全細胞記錄模式后穩(wěn)定4～6 min；記錄電流經(jīng)EPC-9放大器10 kHz 濾波過濾；線性漏電流和電容電流用p/4程序予以刪除, 數(shù)據(jù)和圖形用pulsefit + pulse 8.0 軟件采集分析；實驗結(jié)果用Sigmaplot9.0軟件進行分析。
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