[發(fā)明專利]一種通過(guò)流加次黃嘌呤提高腺苷發(fā)酵產(chǎn)量的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310301845.X
• 申請(qǐng)日: 2013-07-18
• 公開（公告）號(hào): CN103409486A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳寧;劉玥;何菊華;徐慶陽(yáng);謝希賢;張成林;劉淑云
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P19/40
• 分類號(hào): C12P19/40;C12R1/125
• 代理公司: 天津佳盟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術(shù)領(lǐng)域

?本發(fā)明屬于微生物及發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種中間補(bǔ)加前體物發(fā)酵生產(chǎn)腺苷的方法。

背景技術(shù)

腺苷(Adenosine)，即為腺嘌呤核苷，分子式為C₁₀H₁₃N₅O₄、分子量為267.24，化學(xué)名稱為9-β-D-呋喃核糖基腺嘌呤（9-β-D-ribofuranosyl?adenine）。腺苷作為心肌能量代謝的中間產(chǎn)物，在維持心血管系統(tǒng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)和各種損傷機(jī)制中發(fā)揮著重要的病理生理作用。腺苷在美國(guó)是FDA批準(zhǔn)的治療陣發(fā)性室上性心動(dòng)過(guò)速（Paroxysmal?supraventricular?tachycardia，PSVT）的一線藥物，并成為急診處理快速性心律失常和藥物負(fù)荷試驗(yàn)的常規(guī)用藥。

隨著腺苷作用范圍的不斷擴(kuò)大，其市場(chǎng)需求也在不斷增長(zhǎng)，腺苷的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、酶法、發(fā)酵法，而目前國(guó)內(nèi)腺苷的生產(chǎn)主要是化學(xué)法和酶法，成本高、污染嚴(yán)重，推廣應(yīng)用受到嚴(yán)重的限制。發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷的具有反應(yīng)條件溫和，成本低，綠色、清潔、環(huán)保等優(yōu)勢(shì)。因此，在低碳環(huán)保的形勢(shì)下，使用發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷，優(yōu)化腺苷的發(fā)酵工藝，進(jìn)一步提高腺苷的產(chǎn)量，具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是解決現(xiàn)有化學(xué)法和酶法生產(chǎn)腺苷成本高、污染嚴(yán)重，推廣應(yīng)用受限，而發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷產(chǎn)量較低的問(wèn)題，提供一種通過(guò)流加前體物提高腺苷發(fā)酵產(chǎn)量的方法。該方法采用中間補(bǔ)加次黃嘌呤的補(bǔ)料發(fā)酵，可以在發(fā)酵的中后期為菌體代謝提供缺乏的前體物質(zhì)，解除前體物供應(yīng)的瓶頸，有利于代謝目標(biāo)產(chǎn)物的高效合成。

本發(fā)明具體技術(shù)方案

一種通過(guò)流加前體物提高腺苷發(fā)酵產(chǎn)量的方法，該方法采用間歇?jiǎng)蛩傺a(bǔ)料的方式分批發(fā)酵生產(chǎn)腺苷，發(fā)酵菌株采用枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）XGL?（該菌株已于2011年12月31日在中國(guó)生物工程雜志公開發(fā)表，文章為《過(guò)表達(dá)purA基因?qū)ο佘辗e累的影響》，現(xiàn)保藏于天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院菌種保藏中心）。

本發(fā)明方法的具體操作包括以下過(guò)程：

（1）斜面培養(yǎng)：將枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）XGL接種至活化斜面，28~32?℃培養(yǎng)20~28?h；

（2）種子培養(yǎng)：用接種環(huán)刮取斜面菌種接種至種子培養(yǎng)基，28~33?℃，180~220?rpm培養(yǎng)8~11?h，作為發(fā)酵種液；

（3）分批發(fā)酵培養(yǎng)：按10~15%的接種量轉(zhuǎn)接至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，30~34?℃，溶氧維持在10~20%，用NH₃·H₂O調(diào)節(jié)pH，pH為6.0~7.0，培養(yǎng)時(shí)間50~60?h，并且在菌體OD_600*20達(dá)到1.0~1.5以后，例如18~30?h開始，每隔3~6?h間歇?jiǎng)蛩倭骷哟吸S嘌呤溶液，濃度維持在1~5g/L，共流加6~12次，每次20~50?mL。

其中，所述的斜面固體培養(yǎng)基，包含以下組分以g/L計(jì)：葡萄糖?1~3，蛋白胨?5~10，牛肉膏?5~10，酵母粉?2~5?，NaCl?1~2.5，瓊脂20~30，pH?7.0~7.2。

所述的種子培養(yǎng)基，包含以下組分以g/L計(jì)：口服葡萄糖?10~20，玉米漿?15~25?mL/L，豆粕水解液5~10mL/L，酵母粉5~10?，味精3~8，蛋白胨?5~10，KH₂PO₄?0.5~1.5，MgSO₄·7H₂O?0.2~0.8，尿素?2~7，黃嘌呤0.01~0.05，組氨酸0.01~0.05，?pH?7.0~7.2。

所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，包含以下組分以g/L計(jì)：口服葡萄糖?80~120，酵母膏?12~18，味精8~12，K₂HPO₄?1~3，黃嘌呤?0.01~0.05，組氨酸?0.01~0.05，MgSO₄·7H₂O?1~5，MnSO4?0.003~0.006，F(xiàn)eSO₄·7H₂O?0.003~0.006，CaCl₂?1~3?，玉米漿10~20?mL/L，豆粕水解液10~30?mL/L。