[發(fā)明專利]鴨坦布蘇病毒、減蛋綜合癥病毒和新城疫病毒的三重RT-PCR試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310291157.X
• 申請(qǐng)日: 2013-07-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103320540A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝芝勛;曾婷婷;謝麗基;劉加波;鄧顯文;龐耀珊;謝志勤;范晴;羅思思
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于PCR試劑盒技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種鴨坦布蘇病毒、減蛋綜合癥病毒和新城疫病毒的三重RT-PCR試劑盒，以及鑒定或輔助鑒定這三種病毒的引物對(duì)組。

背景技術(shù)

鴨坦布蘇病毒（Duck?Tanbusu?Virus，DTBSV）是引起產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋急劇下降、死亡和小鴨神經(jīng)癥狀、死亡的一種病毒性傳染病的病原。該病主要侵害處于產(chǎn)蛋期的成鴨，可以使處于產(chǎn)蛋高峰期的母鴨的產(chǎn)蛋率在幾天之內(nèi)降到20%以內(nèi)甚至為0，也可以引起雛鴨的神經(jīng)癥狀和死亡，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。減蛋綜合癥病毒（Egg?Drop?Syndrome?Virus，EDSV）是主要引起鴨產(chǎn)蛋下降的一種腺病毒。產(chǎn)蛋鴨感染坦布蘇病毒或減蛋綜合癥病毒之后，同樣都會(huì)引起產(chǎn)蛋下降，且剖檢也會(huì)見(jiàn)到卵巢出血充血等病變。新城疫（Newcastle?disease?Virus，NDV）是引起雞等走禽和飛禽呼吸道、消化道和神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重病變的病毒，之前一直被認(rèn)為對(duì)鴨等水禽的致病性不強(qiáng)，但今年來(lái)陸續(xù)有鴨等水禽感染新城疫病毒后發(fā)病的報(bào)道，說(shuō)明病毒已經(jīng)逐漸適應(yīng)了水禽的機(jī)體，對(duì)水禽產(chǎn)生了致病性。產(chǎn)蛋鴨感染新城疫強(qiáng)毒之后，同樣會(huì)引起產(chǎn)蛋下降，且剖檢也會(huì)見(jiàn)到卵巢出血充血等病變。目前，鴨坦布蘇病毒的檢測(cè)方法包括間接ELISA和PCR，減蛋綜合癥病毒的檢測(cè)方法有HI、PCR等，新城疫病毒的檢測(cè)方法有HI、PCR等。

PCR技術(shù)由于具有敏感性高、特異性好、快速簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，已經(jīng)走進(jìn)臨床診斷實(shí)驗(yàn)室并廣泛應(yīng)用于各種禽病病原體的檢測(cè)，包括用于DTBSV、EDSV和NDV的檢測(cè)。三重RT-PCR是一種特殊的PCR形式，其突出特點(diǎn)是一次RT-PCR反應(yīng)能同時(shí)檢測(cè)并鑒別出三種病原體，在臨床上具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種敏感性好、特異性高、快速方、低成本、高效率便的鴨坦布蘇病毒、減蛋綜合癥病毒和新城疫病毒的三重RT-PCR試劑盒，以及鑒定或輔助鑒定這三種病毒的引物對(duì)組。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：鴨坦布蘇病毒、減蛋綜合癥病毒和新城疫病毒的三重RT-PCR引物組，包括三對(duì)特異性引物，分別是引物1和2（鑒定新城疫病毒）、引物3和4（鑒定減蛋綜合癥病毒）、引物5和6（鑒定鴨坦布蘇病毒），它們分別具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的堿基序列。

引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6的摩爾比為5∶5∶5∶5∶3∶3。

上述鴨坦布蘇病毒、減蛋綜合癥病毒和新城疫病毒的三重RT-PCR引物組在PCR擴(kuò)增方面的應(yīng)用，RT-PCR擴(kuò)增的退火溫度為50℃-60℃。

PCR擴(kuò)增的退火溫度為52℃。

鴨坦布蘇病毒、減蛋綜合癥病毒和新城疫病毒的三重RT-PCR試劑盒，該試劑盒含有以下試劑：A液：引物組和One-Step?RT-PCR試劑盒；引物組包括三對(duì)特異性引物，分別是引物1和2、引物3和4、引物5和6，引物組中引物1至4的濃度為25μM，引物5至6的濃度為15μM，各1μL，One?Step?RT-PCR試劑盒包括2×one-step?reaction?mix（含4種dNTP、RT反應(yīng)緩沖液組成和PCR反應(yīng)緩沖液組成）、TransScript?one-step?emzyme?mix（含反轉(zhuǎn)錄酶和PCR?Taq酶）和去離子水；B液：鴨坦布蘇病毒cDNA、減蛋綜合癥病毒DNA和新城疫病毒cDNA，作為陽(yáng)性對(duì)照；C液：去離子水，作為陰性對(duì)照。

上述鴨坦布蘇病毒、減蛋綜合癥病毒和新城疫病毒的三重RT-PCR試劑盒在RT-PCR擴(kuò)增方面的應(yīng)用，RT-PCR擴(kuò)增的退火溫度為50℃-60℃。

PCR擴(kuò)增的退火溫度為52℃。