[發明專利]一種血管新生蛋白及其應用

有效

• 申請號: 201310287526.8
• 申請日: 2013-07-09
• 公開（公告）號: CN103342744A
• 公開（公告）日: 2013-10-09
• 發明（設計）人: 禹艷紅;陳雷;薛櫻子;蔡冬青;秦俊文;齊緒峰;武征
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C07K14/525
• 分類號: C07K14/525;C12N15/28;C12N15/70;A61K38/19;A61P9/10;A61P3/10;A61P9/00;A61P17/02;A61P37/06
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;陳燕嫻

1.一種促進血管新生蛋白，其特征在于命名為C1ql1-gl1蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.根據權利要求1所述的促進血管新生蛋白，其特征在于：編碼所述的C1ql1-gl1蛋白的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

3.權利要求1所述的促進血管新生蛋白的制備方法，其特征在于由以下步驟實現：

（1）設計C1ql1-gl1蛋白的擴增引物，上游引物P5：5’-CAGAATTCACCTATACCACGGTGCCA-3’；下游引物P4：5’-CCGCTCGAGATCCGAGTAGATGATGAAGCCA-3’；上游引物P5含有EcoRI切割位點，下游引物P4含有Xho?I切割位點，用于擴增引入EcoRI和Xho?I酶切位點的C1ql1基因的球狀結構域核苷酸序列；

（2）制備小鼠cDNA模板，采用Trizol試劑抽提小鼠腦部組織的總RNA，采用First?Strand?cDNA?Synthesis?Kit?ReverTra?Ace-α-^TM合成cDNA一鏈；依此合成的cDNA一鏈為模板，以P5/P4引物進行PCR擴增；PCR擴增反應程序為94℃預變性3min；94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，35個循環；72℃延伸5min；得到特異擴增的引入EcoRI和Xho?I酶切位點的C1ql1-gl1核苷酸序列的PCR擴增產物；

（3）將P5/P4擴增得到的引入EcoRI和Xho?I酶切位點的C1ql1-gl1核苷酸序列的PCR擴增產物，通過EcoRI和Xho?I兩個酶位點，通過分別酶切、回收和連接后克隆到融合表達載體pET32a上，得到重組表達載體pET32a-C1ql1-gl1，通過測序確認引入序列正確；

（4）重組表達載體pET32a-gC1ql1-gl1中的外源片段gC1ql1-gl1與pET32a載體上的TRX標簽融合表達融合蛋白TRX-C1ql1-gl1；將pET32a-gC1ql1-gl1轉化大腸桿菌BL21（DE3）；挑取單菌落接種于含有100ng/ml氨卞的2×YT培養基中，37℃振搖培養過夜活化菌種，按照1:100的體積比接種到500ml的2×YT液體培養基，37℃放大培養至OD600為0.9時，加入IPTG至終濃度為1mM，18℃誘導培養24h后離心收集菌體；將總菌體用Tris緩沖液洗滌，再按照1g菌體用10ml的Tris緩沖液的比例將收集到的菌體懸浮，超聲處理20min后，將超聲后的上清液經Ni²⁺Chelating?Sepharose親和色譜層析純化，先用75mM的咪唑洗Ni²⁺柱，棄洗脫峰，然后直接用150mM的咪唑洗Ni²⁺柱，收集重組蛋白的洗脫峰，獲得含融合蛋白TRX-C1ql1-gl1純度較高的洗脫液；

（5）將融合蛋白TRX-C1ql1-gl1酶切純化C1ql1-gl1蛋白；將步驟（4）獲得的洗脫液過G25凝膠柱脫鹽換酶切緩沖液，然后，在常溫水浴中用重組腸激酶對融合蛋白TRX-C1ql1-gl1酶切過夜，酶切后的C1ql1-gl1蛋白溶液進行Ni²⁺Chelating?Sepharose柱的再次上柱純化去除TRX伴體；酶切后的樣品在上柱時，TRX大部分吸附在Ni²⁺Chelating?Sepharose柱上，C1ql1-gl1蛋白在穿流峰中，收集穿流峰；將收集的穿流峰溶液中的蛋白過Pierce?High-Capacity?Endoxin?Removal?Resin柱子去內毒素后獲得純化的無內毒素的純度在95%以上的C1ql1-gl1蛋白，即制備獲得了促進血管新生蛋白。

4.根據權利要求3所述的促進血管新生蛋白的制備方法，其特征在于：

步驟（2）中所用小鼠為KM小鼠，購自廣東省實驗動物中心。

5.根據權利要求3所述的促進血管新生蛋白的制備方法，其特征在于：

步驟（4）中所述的Tris緩沖液為含50mM?Tris·Cl,150mM?NaCl，pH7.5；

步驟（4）中所述的超聲處理的條件為300W，10s超聲，10s間隔；

步驟（5）中所述的酶切緩沖液為20mM?Tris·Cl，100mM?NaCl，pH8.0。

6.權利要求1或2所述的促進血管新生蛋白的在制備組織器官缺血再灌注損傷的修復、心梗、腦梗、糖尿病引起的心臟病、動脈粥樣硬化的治療藥物以及傷口愈合、器官移植過程中的藥物開發中的應用。