[發(fā)明專利]一種檢測PTEN基因和PI3K/AKT蛋白的方法及其在癌癥治療中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310286800.X
• 申請日: 2013-07-09
• 公開（公告）號: CN103361430A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈浩;郭晗;叢茜;江麗娜;路之越
• 申請（專利權(quán)）人: 北京沁藍(lán)生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N33/68
• 代理公司: 北京國林貿(mào)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11001
• 代理人: 李桂玲;許文娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于核酸、蛋白檢測方法領(lǐng)域，特別涉及一種檢測PTEN基因和PI3K/AKT蛋白的方法及其應(yīng)用。?

背景技術(shù)

乳腺癌目前是世界各地女性中發(fā)病率最高，并且成為女性因癌癥死亡的主要因素。隨著全球人口老齡化及世界總?cè)丝诘某掷m(xù)增長，以及在發(fā)展中國家及地區(qū)醫(yī)療設(shè)施的落后，癌癥的發(fā)病率急劇上升。根據(jù)2011年A?Cancer?Journal?for?Clinicians?在線出版了《Global?Cancer?Statistics》全球腫瘤統(tǒng)計(jì)報告中顯示，約有1270萬癌癥病例和760萬癌癥死亡者進(jìn)行了評估，其中約56%的癌癥病例和64%的癌癥死亡者來自發(fā)展中國家或地區(qū)。乳腺癌在女性中發(fā)病率高，并且為女性癌癥死亡的主要因素，占所有女性癌癥病例的23%和癌癥死亡數(shù)的14%。與十幾年前相比，發(fā)展中國家或地區(qū)的女性癌癥死亡的主因已從以宮頸癌為最常見原因，轉(zhuǎn)變?yōu)橐匀橄侔?。甚至，發(fā)展中國家或地區(qū)的女性肺癌死亡率與宮頸癌一樣高，以上兩項(xiàng)均占女性癌癥死亡數(shù)的11%。雖然發(fā)展中國家或地區(qū)中兩性癌癥總發(fā)病率為發(fā)達(dá)國家或地區(qū)的一半，但是癌癥的死亡率卻是相似的。發(fā)展中國家或地區(qū)中癌癥患者將更加貧窮，大概是因?yàn)榛颊咄砥诰驮\及沒有得到適時的、標(biāo)準(zhǔn)化的治療。?

在所有的乳腺癌患者中，HER2的過表達(dá)與之密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)?20%-25%的乳腺癌患者存在?HER2?基因的過表達(dá)或擴(kuò)增。過表達(dá)的?HER2?與其他受體（尤其是?HER3）形成親和力更強(qiáng)的異源二聚體，表現(xiàn)出更強(qiáng)的信號傳導(dǎo)能力。如激活?MAPK?通路，進(jìn)一步激活其轉(zhuǎn)錄因子?c-myc、c-jun?等，促進(jìn)腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)化；激活?PI3K/AKT通路，活化的?AKT?可促使?p53?降解，還可以激活核因子-κB(NF-κB），降低?TNF-α的抗腫瘤能力。除此之外，高表達(dá)的?HER2?還可以抵抗他莫昔芬對雌激素受體陽性乳腺癌的治療作用，這可能與?HER2?減低類固醇激素的表達(dá)有關(guān)。HER2?分子在乳腺癌發(fā)生發(fā)展及治療耐藥中起著重要的作用。?

曲妥珠單抗（赫賽?。┦侵亟M人源化單克隆抗體，能與?HER2?的胞外區(qū)域特異性結(jié)合，是美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的第一個用于治療?HER2?過表達(dá)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的生物治療藥物。研究顯示，在HER2陽性乳腺癌婦女中，赫賽汀作為單藥治療、聯(lián)用標(biāo)準(zhǔn)化療或在標(biāo)準(zhǔn)化療后使用，均可提高反應(yīng)率、無病生存期和總生存期，同時保證生活質(zhì)量。自1998年以來，赫賽汀已經(jīng)在全世界用于治療超過45萬名HER2陽性乳腺癌患者。?

然而曲妥珠單抗（赫賽汀）對于患者的治療費(fèi)用也是相當(dāng)可觀的，在中國藥用曲妥珠單抗一個療程大概需要200,000人民幣。曲妥珠單抗用于治療?HER2?過表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，取得了較好的治療效果，然而其單獨(dú)治療客觀反應(yīng)率卻不高，9?個月的中位生存期只有?12%-34%，并且多數(shù)患者在使用該藥一年之內(nèi)就產(chǎn)生了耐藥。?

因此，目前急需一種能夠準(zhǔn)確、有效判斷乳腺癌患者對曲妥珠單抗耐藥性的方法。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測PTEN基因和PI3K/AKT蛋白表達(dá)的方法，并且所述方法可用于檢測乳腺癌患者對曲妥珠單抗的耐藥性。?

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：?

一種檢測PTEN基因和PI3K/AKT蛋白的方法，所述的檢測方法包括以下步驟：

A.?DNA測序操作

1）總DNA提取：取手術(shù)患有乳腺癌患者的新鮮乳腺組織，生理鹽水沖洗，并將所述組織剪碎，提取總DNA；

2）PCR擴(kuò)增目的片段：以所述提取的總DNA為模板，以人工合成DNA序列為引物，利用PCR儀器進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物；

3）瓊脂糖凝膠電泳：利用瓊脂糖凝膠電泳將所述PCR產(chǎn)物，進(jìn)一步純化，將目的片段切下，進(jìn)行DNA測序；

B.?Western?Bloting操作

1）取手術(shù)患有乳腺癌患者的新鮮乳腺組織，將所述組織置于冰上，并用滅菌的預(yù)冷工具分離所述組織，得到組織塊；

2）將所述組織塊放入圓底Eppendorf管中，向管中加入液氮冷凍所述組織塊，并將所述Eppendorf管置于冰上，進(jìn)行均勻研磨，得到組織研磨物；

3）向所述組織研磨物中加入裂解緩沖液，所述裂解液加入的量為60μl/mg，冰浴下勻漿處理，而后將所述Eppendorf管置于4℃搖動1~2h，得到組織勻漿物，所述組織勻漿物中蛋白濃度至少達(dá)到0.1mg/ml；