[發(fā)明專利]一種牛睪丸細(xì)胞系及其建立方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310285025.6
• 申請日: 2013-07-08
• 公開（公告）號: CN103849602A
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王文秀;沈志強(qiáng);管宇;魏鳳
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12R1/91
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11129
• 代理人: 謝殿武

1.一種牛睪丸細(xì)胞系，其保藏號為：CCTCC?C201399。

2.權(quán)利要求1所述的牛睪丸細(xì)胞系的應(yīng)用。

3.權(quán)利要求2所述的應(yīng)用是指在生產(chǎn)豬瘟疫苗、羊痘、羊口瘡疫苗中的應(yīng)用。

4.權(quán)利要求2所述的牛睪丸細(xì)胞系在研究豬瘟病毒、羊痘病毒及羊口瘡病毒在睪丸細(xì)胞增殖中的應(yīng)用。

5.權(quán)利要求2所述的牛睪丸細(xì)胞系在分離或鑒定羊痘病毒以及研制羊痘病毒疫苗的應(yīng)用。

6.權(quán)利要求2所述的牛睪丸細(xì)胞系在外源基因轉(zhuǎn)染、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞融合研究中的應(yīng)用。

7.權(quán)利要求1所述的牛睪丸細(xì)胞系的建立方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）原代培養(yǎng)：采集初生犢牛睪丸，剪成0.5～2.0mm³的組織塊，分離得高活力的牛睪丸細(xì)胞，培養(yǎng)，得原代牛睪丸細(xì)胞；

（2）轉(zhuǎn)染和篩選：提取、純化含有hTERT基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-neo-hTERT，將提取、純化的的真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-neo-hTERT導(dǎo)入步驟(1)所得原代牛睪丸細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染；

（3）篩選和擴(kuò)大培養(yǎng)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-neo-hTERT后待細(xì)胞匯合至80％時，傳至另一個24孔培養(yǎng)板中，48h后用G418篩選液進(jìn)行G418篩選；

待對照孔的細(xì)胞全部死亡后，將G418篩選液的濃度降低維持G418篩選，將G418篩選陽性的克隆細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板中，然后消化傳代至24孔培養(yǎng)板擴(kuò)大培養(yǎng)，繼續(xù)進(jìn)行G418篩選，得抗G418的陽性細(xì)胞；

（4）將步驟（3）所得抗G418的陽性細(xì)胞于培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行體外連續(xù)傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)超過60代，獲得永生化的牛睪丸細(xì)胞系；所述體外連續(xù)傳代培養(yǎng)采用消化法。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的建立方法，其特征在于，還包括細(xì)胞凍存步驟，該步驟按順序如下：

更換步驟（4）培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；

用胰酶消化培養(yǎng)細(xì)胞，然后加入培養(yǎng)基終止反應(yīng)；

計數(shù)；

收集：離心，去上清液，加入凍存液，混勻，使細(xì)胞重懸，將培養(yǎng)的細(xì)胞分裝入凍存管封口；

預(yù)凍：4℃預(yù)凍凍存管30～60min，-20℃預(yù)凍1～2h，-70℃預(yù)凍6～12h；

凍存：將-70℃預(yù)凍的凍存管迅速投入液氮柜中；

所述的凍存液的各成分所占體積百分比為：10%DMSO、60%胎牛血清和30%DMEM。

9.權(quán)利要求8所述的建立方法，其特征在于，步驟（1）所述的培養(yǎng)是指高活力的牛睪丸細(xì)胞培養(yǎng)于完全的DMEM培養(yǎng)基中；

所述完全的DMEM培養(yǎng)基為向液態(tài)DMEM培養(yǎng)基中加入體積比為10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的建立方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染包括如下步驟：

（1）轉(zhuǎn)染前24h，將牛睪丸細(xì)胞用消化成單個細(xì)胞，接種到24孔板內(nèi)，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染當(dāng)天能達(dá)到80％～90％的融合；

（2）轉(zhuǎn)染前4h，將完全的DMEM培養(yǎng)基更換成液態(tài)DMEM培養(yǎng)基；

（3）用液態(tài)DMEM培養(yǎng)基將三份5μL的pCI-neo-hTERT質(zhì)粒均稀釋至50μL，得到稀釋的質(zhì)粒DNA；

（4）用液態(tài)DMEM培養(yǎng)基分別稀釋6μL、9μL、12μL的Lipofectamine2000到50μL，得到稀釋的Lipofectamine2000；

（5）分別混合步驟（3）的稀釋的質(zhì)粒DNA和步驟（4）的稀釋的Lipofectamine2000，得混合物；

（6）吸出步驟（1）的24孔板中的培養(yǎng)基，用D-Hank’s清洗，加入900μL液態(tài)DMEM培養(yǎng)基；

（7）加入步驟（5）的混合物到不同孔中，混勻；同時設(shè)立空白對照；

（8）于體積分?jǐn)?shù)為5％CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育，棄去培養(yǎng)基，加入完全的DMEM培養(yǎng)基；

（9）觀察細(xì)胞，并及時換液。