[發(fā)明專(zhuān)利]一種高消化率高粱品系的分子鑒定法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310281699.9
• 申請(qǐng)日: 2013-07-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103305624A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李杰勤;王麗華;詹秋文;林平;王茂輝
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 安徽科技學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
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• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

一種高消化率高粱品系的分子鑒定法屬于高粱分子育種技術(shù)，更具體的說(shuō)是一種通過(guò)分子標(biāo)記鑒定高消化率高粱基因的方法。

背景技術(shù)

高粱褐色中脈是一種葉脈和莖桿木質(zhì)部的變異現(xiàn)象。這種突變體與普通的白色中脈高粱相比消化率提高40%-60%，適口性明顯改善，各種放牧家畜特別喜食，同樣的飼喂量可獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益。褐色中脈類(lèi)型有三十多種，而其中消化率最高的為bmr-6類(lèi)型。常規(guī)的培育褐色中脈（bmr-6類(lèi)型）高粱與蘇丹草的方法是利用表型來(lái)進(jìn)行選擇，由于褐色中脈是隱性性狀，在回交當(dāng)代不能直接通過(guò)表型進(jìn)行鑒定。如進(jìn)行表型鑒定需自交一代后再種植鑒定，這樣需要2個(gè)生長(zhǎng)季才能完成，費(fèi)時(shí)、費(fèi)工；而利用分子標(biāo)記方法鑒定、選擇攜帶有bmr-6基因的單株，可在幾天時(shí)間內(nèi)完成bmr-6基因的鑒定、選擇工作，且準(zhǔn)確性高，結(jié)果可靠。本方法可簡(jiǎn)化選擇程序，節(jié)約選擇時(shí)間，操作簡(jiǎn)便，能夠加快育種進(jìn)程。目前，還未見(jiàn)該方法的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是采用分子標(biāo)記的方法來(lái)鑒定高粱品系中控制高消化率的的基因，縮短鑒定時(shí)間，以期達(dá)到方法易行，快速方便，效果良好的技術(shù)效果。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種高消化率高粱品系的分子鑒定法的特征在于，利用SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到目的片段回收后酶切DNA，再用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所得酶切片段，確定植株是否攜帶bmr-6基因。

本發(fā)明包括如下步驟：

①選用引物B-1：前引物為，GACGGCCGGCACGCG；后引物為，TTCAGACTTCAGACCAAC。

②PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃?預(yù)變性?5min；94℃變性?30s，58℃退火30s，68℃?延伸30s，34個(gè)循環(huán)；最后再延伸7?min，4℃保存。

③電泳檢測(cè)：取擴(kuò)增好的DNA產(chǎn)物5μL，用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如有一條長(zhǎng)度200bp左右的帶則說(shuō)明目標(biāo)序列已擴(kuò)增好。

④酶切：利用DNA回收試劑盒將擴(kuò)增好的溶液回收，取20μL用Mlu?I酶進(jìn)行酶切。

⑤電泳檢測(cè)酶切片段：用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切后的DNA，電壓150V，電泳30分鐘，用成像儀拍照觀察，如出現(xiàn)2條帶說(shuō)明該單株攜帶bmr-6基因，如只有1條帶則不攜帶該基因。

2.步驟②中所述的PCR擴(kuò)增的總體系為30μL：DNA?100ng，?2mM?引物?5μL，2?mM?DNTP?6μL，KOD酶?0.5U，2倍緩沖液15μL，剩余用雙蒸水補(bǔ)齊。

3.步驟④所述的酶切體系40μL：DNA?20μL，內(nèi)切酶3μL，10倍酶切緩沖液4μL，雙蒸水13μL。

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本發(fā)明的有益效果：一種高消化率高粱品系的分子鑒定法利用分子標(biāo)記方法鑒定、選擇攜帶有bmr-6基因的單株，簡(jiǎn)化選擇程序。本方法簡(jiǎn)便，操作容易，能夠加快育種進(jìn)程。另外，本發(fā)明也可用于高消化率蘇丹草品系的分子鑒定。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述。

實(shí)施例1：高消化率的高粱品系的分子標(biāo)記鑒定

1.?高消化率品系雜交：利用褐色中脈高粱品系U68（bmr-6類(lèi)型）與高粱品系Tx623B雜交。

2.?第一次回交：以雜交種為母本，高粱Tx623B為父本進(jìn)行回交，獲得BC₁F₁。

3.?后代單株分子標(biāo)記鑒定：BC₁F₁種20株，分單株提取DNA，對(duì)攜帶褐色中脈基因的單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。

鑒定程序如下：

①.利用引物B-1（前引物為：GACGGCCGGCACGCG；后引物為：TTCAGACTTCAGACCAAC）對(duì)這20個(gè)單株DNA進(jìn)行擴(kuò)增（總體系為30μL:?DNA?100ng?2mM?引物?5μL，2?Mm?DNTP?6μL，KOD酶?0.5U，2倍緩沖液15μL，剩余用雙蒸水補(bǔ)齊。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃?預(yù)變性?5min；94℃變性?30s，58℃退火30s，68℃?延伸30s，34個(gè)循環(huán)；最后再延伸7?min，4℃保存。）

②.?取擴(kuò)增好的DNA產(chǎn)物5μL，用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如有一條長(zhǎng)度200bp左右的帶則說(shuō)明目標(biāo)序列已擴(kuò)增好。

③.?利用DNA回收試劑盒將擴(kuò)增好的溶液回收，取20μL用Mlu?I酶切（酶切體系40μL：DNA?20μL，內(nèi)切酶3μL，10倍酶切緩沖液4μL，雙蒸水13μL）。