[發(fā)明專利]膝溝藻毒素GTX2,3完全抗原及單克隆抗體的制備

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310279284.8
• 申請日: 2013-07-04
• 公開（公告）號: CN103319591A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何培民;賈睿;張洋;蔡春爾;崔峰;楊欣欣;邱軍強
• 申請（專利權(quán)）人: 上海海洋大學(xué)
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K1/107;C07K16/14
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31227
• 代理人: 吳瑾瑜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種膝溝藻毒素GTX2,3完全抗原及單克隆抗體的制備。?

背景技術(shù)

有害赤潮及其有毒赤潮生物給海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和海洋食品安全構(gòu)成巨大的威脅，其中有毒赤潮藻產(chǎn)生的赤潮毒素對海洋生物、人、畜等的危害尤其巨大。麻痹性貝類毒素是我國最常見的赤潮毒素之一，最初因其神經(jīng)麻痹作用而得名；因其分布范圍最廣對人類危害最嚴(yán)重而受到人們極大的關(guān)注，成為全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和海洋食品進(jìn)出口部門重點檢測的對象。?

PSP是一系列帶有肌基的三環(huán)氨基甲酸脂類化合物及其衍生物，類似于具有兩個肌基的嚓吟核，為非結(jié)晶、水溶性、高極性、不揮發(fā)的小分子物質(zhì)，屬非蛋白質(zhì)毒素，在酸性條件下穩(wěn)定，堿性條件下發(fā)生氧化，毒性消失;毒素遇熱穩(wěn)定，并不被人的消化酶所破壞。在紫外線范圍內(nèi)不被吸收，pKa值在8.2到8.5間，旋光度大概是+130。?

世界各國對PSP分類雖各不相同，但目前己分離出20多種毒素。膝溝藻毒素1-4屬于其中的氨基甲酸醋類毒素(Carbamatetoxins)，?

Shimizu等將G.tamarensis赤潮區(qū)毒蛤提取物以Sephadex-15過?濾，AlllberiliteIRe50層析，稀鹽酸或醋酸洗脫，在不同的pH區(qū)間劃分出三個毒性成分，又以Sephadex-15或Bio-ge1P-2自毒蛤或G.tamarcnsis細(xì)胞提取物中分離出兩個毒性部分，其中一個為石蛤房毒素，另一部分命名為gonyautoxin，即膝溝藻毒素，簡稱GTX。用Bin-Rex70做載體對GTX做高效液相色譜分離，以稀酸做線性梯度洗脫，得到三個化合物，即GTXI、GTX2和GTX3。Shimizu等依據(jù)核磁共振和降解反應(yīng)對GTX2和GTX3的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了探討，得出GTX2是11-羥基石蛤房毒素，GTX3是其差向異構(gòu)體。隨著對膝溝藻毒素研究的不斷深入，新的膝溝藻毒素也不斷被發(fā)現(xiàn)，目前己發(fā)現(xiàn)的膝溝藻毒素大約有10種。其中GTXZ2,3是我國南方沿海染毒貝類和有毒赤潮藻常見的一種麻痹性貝類毒素之一。?

免疫學(xué)檢測方法具有快速、高效、簡便、適合大規(guī)模推廣應(yīng)用等特點。用于PSP毒素的免疫分析的主要是多克隆抗體和單克隆抗體。一般而言，多克隆抗體比單克隆抗體的生產(chǎn)更加快速而且價廉，對復(fù)雜表位具有較高的親和力，可以得出異源性廣譜分析;單克隆抗體產(chǎn)生于一個永久性的細(xì)胞譜系，盡管它們的多譜系副本穩(wěn)定性略低，但能以較低的變異性連續(xù)產(chǎn)生，更加適用于單一表位的檢測。單克隆抗體具有質(zhì)地均一、特異性強、滴度高、反應(yīng)靈敏、可標(biāo)準(zhǔn)化，并能進(jìn)行工業(yè)性大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點。?

由于GTX2,3的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有胍基，可以與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上的氨基在甲醛作為偶聯(lián)劑的作用下進(jìn)行偶聯(lián)。該技術(shù)的不足之處在于不能大量的制備該完全抗原，原因是GTX2,3標(biāo)準(zhǔn)液非常昂貴且不易獲取。?參考文獻(xiàn)為：Production?of?antibodies?and?development?of?highly?sensitive?formats?of?enzyme?immunoassay?for?saxitoxin?analysis.?

現(xiàn)有技術(shù)中，用甲醛法將GTX2,3與載體蛋白KLH，即GTX2,3與甲醛在弱酸性條件下與KHL蛋白在25℃下反應(yīng)72h，再于4℃下反應(yīng)12h偶聯(lián)制備完全抗原，免疫Baib/C小鼠。用GTX2,3-KHL完全抗原免疫小鼠的效價并不高，需要多次免疫才能達(dá)到1：10⁴。?

用上述方法制備的GTX2,3-BSA偶聯(lián)物，以及用高碘酸鹽氧化法制備GTXZ2,3-GOX偶連物在現(xiàn)有技術(shù)中作為檢測抗原，用于直接和間接競爭酶免疫學(xué)檢測方法。?

由于GTX2,3標(biāo)準(zhǔn)液或標(biāo)準(zhǔn)樣品昂貴且不易獲取，因此大量制備完全抗原有困難，這也限制了GTX2,3單克隆抗體的制備和產(chǎn)量。為了大量獲取GTX2,3單克隆抗體，提高其制備效率，需要提高GTX2,3完全抗原的免疫效價，以提高單抗的產(chǎn)率，降低成本。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種膝溝藻毒素GTX2,3的完全抗原及制備方法，所獲得的完全抗原具有很高的免疫效價。?

上述完全抗原可用于制備膝溝藻毒素GTX2,3的單克隆抗體。?

技術(shù)方案為，將膝溝藻毒素GTX2,3與BSA用甲醛偶聯(lián)，得到GTX2,3-BSA偶聯(lián)物。制備得到的GTX2,3-BSA偶聯(lián)物為GTX2,3的完全抗體，用來免疫注射小鼠，得到GTX2,3單克隆抗體。?