[發明專利]IFN?α處理細胞所分泌外體在制備抑制肝炎病毒的藥物中的應用

有效

• 申請號: 201310278403.8
• 申請日: 2013-07-04
• 公開（公告）號: CN104274828B
• 公開（公告）日: 2017-11-17
• 發明（設計）人: 袁正宏;李建華
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: A61K38/21
• 分類號: A61K38/21;A61K38/43;A61P1/16;A61P31/14;A61P31/20;A61P37/02;A61K31/70
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙)31268
• 代理人: 吳桂琴

技術領域

本發明屬于分子生物學和醫藥領域，涉及干擾素-alpha(IFN-α)處理細胞所分泌外體作為抗病毒治療的應用。

背景技術

由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）和和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）持續性感染引起的慢性肝炎是嚴重危害人類健康的疾病。臨床上針對HBV和HCV感染的抗病毒藥物主要為核苷類似物和干擾素-α（Interferon-α,IFN-α），但均有一定的局限性，包括應答效率低，耐藥性，以及耐受性等問題。

肝臟是一個具有極強固有免疫功能的器官，由肝實質細胞（肝細胞）和肝非實質細胞組成。肝非實質細胞主要包括庫否細胞（肝臟常駐的巨噬細胞）、肝竇內皮細胞和淋巴細胞等細胞組成。肝非實質細胞是否在IFN-α治療乙型肝炎和丙型肝炎中的起作用，以及通過何種方式作用以前均未有研究。近期研究報道外體（exosomes）是一類由細胞主動分泌的大小介于30-100nm，內含蛋白質、RNA和脂質的微囊結構，廣泛存在于各種體液中。已報道外體能介導細胞間的通信，通過水平轉移到鄰近或遠處的靶細胞，參與調控多種重要的細胞生理或病理活動。

發明內容

本發明的目的是提供一種抑制HBV和HCV再復制的物質，所述的物質優選干擾素-alpha(IFN-α)處理細胞所分泌外體。

本發明的另一個目的是提供一種抑制HBV和HCV在肝細胞中復制的方法。

本發明經細胞和動物模型水平的實驗證實，IFN-α刺激肝非實質細胞（包括巨噬細胞和肝竇內皮細胞）所分泌外體（exosomes）能抑制HBV和HCV在肝細胞中復制，可作為一種新型抗病毒治療手段。

IFN-α處理肝非實質細胞上清通過一系列分步超速離心純化得到外體，分離的外體經過電子顯微鏡負染確定外體大小，與Western blot檢測外體標志蛋白或保守蛋白，鑒定外體純度。

IFN-α處理肝非實質細胞后純化得到的外體，加入乙肝病毒復制細胞或丙型肝炎病毒復制細胞中，通過Southern blot和Northern blot方法，以及Gaussia熒光素酶報告系統方法確定外體能否抑制HBV和HCV生活周期的關鍵環節。發現經超速離心純化的、IFN-α處理的肝非實質細胞分泌的外體能下調病毒的RNA和DNA水平直接抑制HBV的復制，同時也能抑制HCV的復制及蛋白表達。同時，肝非實質細胞所分泌外體能被肝細胞以內吞的方式內化，并且這種內化過程為外體抑制HBV復制所必需。

進一步通過Wenstern blot和生物芯片（microarray）方法發現IFN-α處理的肝非實質細胞釋放的外體有多種內容物，其中抗病毒蛋白去氨基酶APOBEC3G，及618個mRNA和3個microRNA在IFN-α處理的肝非實質細胞釋放的外體中上調表達；利用qRT-PCR技術驗證了microAarry的結果。

通過檢測外體的去氨基酶活性、mRNA的翻譯能力和抑制microRNA靶報告質粒的熒光素酶活性，證實外體攜帶的差異分子是有功能的。進一步通過體外共轉染mRNA表達質粒（或miRNA mimic）與pHBV1.3質粒，用Southern blot和Northern blot檢測HBV復制抑制，發現APOBEC3G、mRNA和microRNA在外體抑制HBV復制中發揮了重要作用。

本發明提供了由干擾素-alpha處理的細胞分泌產生的外體在制備抑制乙肝病毒或者丙肝病毒的藥物中的應用。

所述的抑制乙肝病毒或者丙肝病毒包括對乙肝病毒HBeAg、HBsAg蛋白的產生，cccDNA轉錄活性，pgRNA、cccDNA含量的抑制作用，或者對丙肝病毒的蛋白、RNA的抑制作用。

所述的外體可以由擾素-alpha刺激細胞后，收集上清，分步超速離心，獲得純化的外體。

在本發明的一個優選例中，采用1000IU/ml的IFN-α處理細胞。

超速離心一般不超過10,000。在本發明的一個優選例中，經過300g離心10分鐘，小心吸取上清到新管，以后依次，2000g離心10分鐘，10000g離心30分鐘，100,000g離心70分鐘，最后加入PBS清洗100,000g離心70分鐘，獲得純化外體。

通常，該外體含有抗病毒蛋白去氨基酶、mRNA和microRNA。

所述的細胞是肝非實質細胞。

所述的肝非實質細胞是巨噬細胞或者肝竇內皮細胞。