[發明專利]一種分離產氫衣藻葉綠體的方法

有效

• 申請號: 201310276602.5
• 申請日: 2013-07-03
• 公開（公告）號: CN104277974B
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 黃芳;孫永樂;張錦;陳梅
• 申請（專利權）人: 中國科學院植物研究所
• 主分類號: C12N1/12
• 分類號: C12N1/12;C12R1/89
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢

1.一種分離產氫衣藻葉綠體的方法，包括如下步驟：

(1)將待分離的產氫衣藻細胞懸浮于裂解緩沖液中，向其中加入皂素，得到懸浮液1；

所述皂素在所述懸浮液1中的含量為每100mL所述懸浮液1中含有0.25g所述皂素；

(2)將所述懸浮液1置于冰上1-2min，使所述產氫衣藻細胞裂解，得到懸浮液2；

(3)將所述懸浮液2于4℃2300g離心1min，收集沉淀；

(4)用所述裂解緩沖液對步驟(3)所得沉淀進行漂洗，4℃1000-2300g離心1min，收集沉淀，得到葉綠體粗提物；

(5)將所述葉綠體粗提物懸浮于所述裂解緩沖液中，得到懸浮液3；

(6)在離心管底層加入體積分數為75％的Percoll緩沖液，上層加入體積分數為45％的Percoll緩沖液，形成Percoll梯度，在所述體積分數為45％的Percoll緩沖液上方加入所述懸浮液3，4℃4600g離心20min，離心后可見位于所述體積分數為45％的Percoll緩沖液和所述體積分數為75％的Percoll緩沖液之間的界面上有墨綠色條帶；

(7)取出所述墨綠色條帶，用所述裂解緩沖液稀釋，4℃890-1000g離心2min，收集沉淀，獲得所述葉綠體；

所述產氫衣藻為：將衣藻在缺硫條件下進行培養，得到的處于產氫狀態的衣藻；

所述將衣藻在缺硫條件下進行培養的培養時間為24-48h；

所述將衣藻在缺硫條件下進行培養的培養液為缺硫TAP培養液，所述缺硫TAP培養液為將正常TAP培養液中的硫化物以等摩爾換成相應的氯化物；

所述正常TAP培養液的pH為7.0，組成如下：NH₄Cl 0.4g/L；MgSO₄·7H₂O 0.1g/L；CaC1₂·2H₂O 0.05g/L；K₂HPO₄ 0.108g/L；KH₂PO₄ 0.056g/L；Trisbase 2.423g/L；亨特微量元素(Hunter’s trace elements)1ml/L，冰乙酸1ml/L，余量為水；

所述亨特微量元素的pH為7.0，組成如下：H₃BO₄ 11.4g/L，ZnSO₄·7H₂O 22.0g/L，MnCl₂·4H₂O 5.06g/L，CoCl₂·6H₂O 1.61g/L，CuSO₄·5H₂O 1.57g/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 1.10g/L，FeSO₄·7H₂O 4.99g/L，余量為水；

所述將衣藻在缺硫條件下進行培養時，所述衣藻在所述缺硫TAP培養液中的含量為每mL所述缺硫TAP培養液中含有葉綠素總量為25μg的所述衣藻；

所述將衣藻在缺硫條件下進行培養的培養溫度為25℃，光強為120μE·m^-2·s^-1，持續光照，密封培養；

所述裂解緩沖液的pH為7.8，溶劑為水，溶質及濃度如下：0.3M山梨醇、50mM HEPES-KOH、5mM MgCl₂；

所述體積分數為75％的Percoll緩沖液的pH為7.8，組成如下：體積分數為75％的Percoll、終濃度為0.33M的山梨醇、終濃度為50mM的HEPES-KOH、終濃度為5mM的MgCl₂，余量為水；

所述體積分數為45％的Percoll緩沖液的pH為7.8，組成如下：體積分數為45％的Percoll、終濃度為0.33M的山梨醇、終濃度為50mM的HEPES-KOH、終濃度為5mM的MgCl₂，余量為水；

所述衣藻為萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC400。