[發(fā)明專利]耐熱耐堿和鹽穩(wěn)定的外切菊粉酶及其編碼基因與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310275633.9
• 申請日: 2013-07-03
• 公開（公告）號: CN103333871A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 盧偉東;龐海強;郭立忠
• 申請（專利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/63;C12P19/14
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種耐熱耐堿和鹽穩(wěn)定的外切菊粉酶的氨基酸序列和核苷酸序列、外切菊粉酶重組表達載體的構(gòu)建及其應(yīng)用。?

背景技術(shù)

菊粉(Inulin)又稱為菊糖，因最早是從菊科植物中分離出來而得名。自然界中雙子葉植物中的菊科、龍膽科、橘梗科等11個科以及單子葉植物中的百合科、禾本科等都含有菊粉。菊粉大量存在于菊芋、菊苣、蒲公英、牛蒡和大麗花等植物中，這些植物在我國廣泛種植。菊粉是由D-呋喃果糖經(jīng)β-2，1-糖苷鍵脫水聚合而成的多聚果糖。菊粉的還原端以α-(1，2)-糖苷鍵連接一分子的葡萄糖殘基，呈直鏈結(jié)構(gòu)。菊粉的生理功能已引起了全世界廣泛的關(guān)注。研究表明，菊粉屬于一種可溶性膳食纖維，是體內(nèi)雙歧桿菌及乳酸菌增強因子，具有重要的生理功能。菊粉可以改善腸道的微環(huán)境，促進礦物元素的吸收，特別是鈣、鎂等成骨元素的吸收。菊粉不能被人體消化分解成可直接吸收利用的糖類，因而不會影響血糖的水平，菊粉對調(diào)節(jié)血糖有一定作用。菊粉還可以通過降低血中膽固醇和甘油三脂的含量，來調(diào)節(jié)血脂的水平，減少心血管疾病的危害。菊粉是可溶性的膳食纖維，不能被消化利用，可以預(yù)防肥胖癥。另外菊粉具有潛在抗癌作用，菊粉在腸道內(nèi)被某些細(xì)菌發(fā)酵后產(chǎn)生短鏈的脂肪酸，特別是丁酸，具有抗癌作用。菊粉可以在菊粉酶的作用下水解生成果糖和寡聚果糖。果糖甜度高，風(fēng)味好，熱值低，不易造成齲齒，糖尿病患者也可利用。又因高果糖漿味甜、爽口，滲透壓高，保藏效果好，所以己成為世界上很多國家的主要甜味劑。低聚果糖可抑制腸內(nèi)沙門氏桿菌和大腸桿菌的生長，促進腸胃功能，減少腸內(nèi)腐敗物質(zhì)，防止便秘，增加維生素的合成，提高動物免疫功能；促進體內(nèi)雙歧桿菌的增殖，建立雙歧桿菌的優(yōu)勢種群；促進微量元素鐵、鈣的吸收利用；保護動物肝臟，促進營養(yǎng)轉(zhuǎn)化，?是一種功能性飼料添加劑，又被稱為原生素(PPE)。?

根據(jù)作用底物方式的不同，或者說根據(jù)菊粉酶酶切果聚糖鏈方式的不同菊粉酶可以分為內(nèi)切菊粉酶(EC3.2.1.7)和外切菊粉酶(EC3.2.1.80)。菊粉酶的來源很廣，包括自然界中的植物、土壤、水和動物消化道中的許多微生物，都可以分泌菊粉酶。微生物來源的菊粉酶種類多，熱穩(wěn)定性好，適合用于發(fā)酵生產(chǎn)。?

在菊粉酶的研究和應(yīng)用中遇到的主要困難：一，產(chǎn)酶的成本高，導(dǎo)致應(yīng)用的成本高。主要表現(xiàn)在產(chǎn)菊粉酶菌株的產(chǎn)酶量低，因而提高了應(yīng)用成本，制約了低聚果糖在食品工業(yè)、飼料工業(yè)和生物能源領(lǐng)域中的應(yīng)用。二，目前工業(yè)生產(chǎn)使用的菊粉酶的最適酶反應(yīng)pH均為酸性環(huán)境(pH5.5-6.5)，在中性pH或者堿性pH環(huán)境條件下，酶的活性及其酶的穩(wěn)定性大大降低。這在一定程度上限制了菊粉酶在堿性環(huán)境中的應(yīng)用。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種耐熱耐堿和鹽穩(wěn)定的外切菊粉酶，具體而言，本發(fā)明一方面涉及外切菊粉酶，該外切酶的氨基酸序列為SEQ?ID?NO.1。?

本發(fā)明另一方面還涉及該外切菊粉酶的氨基酸序列所對應(yīng)的基因，所述基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.2或其互補序列。?

另一方面，本發(fā)明還涉及含有上述核苷酸序列的重組載體pET28a-InuB，重組表達載體的構(gòu)建過程見圖1。?

另一方面，本發(fā)明還涉及上述外切菊粉酶的制備方法，其特征在于包括如下步驟：?