[發(fā)明專利]廈門霉素生物合成基因簇、用途及菌株

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310273055.5
• 申請日: 2013-07-01
• 公開（公告）號: CN103740734A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設計）人: 徐俊;楊勇;付玲;徐岷涓;游中元
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N1/21;C12P17/06;C12R1/465
• 代理公司: 上海漢聲知識產(chǎn)權代理有限公司 31236
• 代理人: 牛山;陳少凌

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種廈門霉素生物合成基因簇、用途及菌株。?

背景技術

Streptomyces?xiamenensis的模式菌株是分離自中國福建省紅樹林沉積物的一株鏈霉菌，在此菌株的發(fā)酵液中，發(fā)現(xiàn)了一苯并吡喃衍生物：?

N-[[3，4-dihydro-3S-hydroxy-2S-methyl-2-(4′R-methyl-3′S-pentenyl)-2H-1-ben?zopyran-6-yl]carbonyl]-threonine，結構式如下：?

此化合物由3個結構單元構成：L-蘇氨酸、4-羥基苯甲酸和香葉草基。這類化合物有較低的細胞毒性、良好的細胞膜穿透性。據(jù)報道此化合物具有抑制ICAM-1(細胞間粘附分子-1)/LFA-1(淋巴細胞功能相關抗原-1)介導的細胞粘附作用，具有開發(fā)為抗炎和抗纖維化藥物的潛力。異戊烯基取代的苯并吡喃類化合物，主要來源有：植物提取、全化學合成和化學酶學合成，本發(fā)明涉及利用微生物培養(yǎng)生物合成此類化合物。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種廈門霉素生物合成基因簇、用途及菌株，具體為從廈門鏈霉菌中克隆并獲得苯并吡喃類生物堿(廈門霉素)的生物合成方法及通過異源表達在其它鏈霉菌中生物合成該化合物，并通過引入抗生素抗性提高該化合物產(chǎn)量的方法。?

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的，?

第一方面，本發(fā)明涉及一種廈門霉素的生物合成基因簇，所述基因簇的堿基序列如SEQ?ID?NO.1所示，全長為5189個堿基。?

優(yōu)選的，所述基因簇包含基因ximA，ximB，ximC，ximD和ximE；具體為：?

ximA：位于SEQ?ID?NO.1第1-1563堿基處，編碼520個氨基酸；?

ximB：位于SEQ?ID?NO.1第1788-2729堿基處，編碼313個氨基酸；?

ximC：位于SEQ?ID?NO.1第2795-3385堿基處，編碼196個氨基酸；?

ximD：位于SEQ?ID?NO.1第3394-4815堿基處，編碼473個氨基酸；?

ximE：位于SEQ?ID?NO.1第4815-5189堿基處，編碼124個氨基酸。?

第二方面，本發(fā)明涉及前述生物合成基因簇在生產(chǎn)廈門霉素中的用途。?

第三方面，本發(fā)明涉及一種廈門鏈霉菌(Streptomyces?xiamenensis)CGMCC?No.5670。?

第四方面，本發(fā)明涉及如前述的廈門鏈霉菌的突變菌株，通過將突變型rpsL基因轉入所述廈門鏈霉菌而得。?

優(yōu)選地，所述突變菌株為廈門鏈霉菌(Streptomyces?xiamenensis)CGMCC?No.5674、廈門鏈霉菌(Streptomyces?xiamenensis)CGMCC?No.5675或廈門鏈霉菌(Streptomyces?xiamenensis)CGMCC?No.5676。?

第五方面，本發(fā)明涉及一種廈門霉素的生產(chǎn)方法，取前述的廈門鏈霉菌或其突變菌株或攜帶前述的廈門霉素生物合成基因簇的基因工程菌株，發(fā)酵，可得廈門霉素。?

本發(fā)明的廈門霉素生物合成基因簇的克隆及其異源表達的方法具體為：?

步驟一，提取該鏈霉菌的基因組DNA，建立Fosmid文庫；?

步驟二，根據(jù)該基因組掃描的結果，用針對異戊烯基轉移酶設計的引物對待選菌株基因組文庫進行PCR擴增，篩選到陽性克隆p9A11；?

步驟三，以p9A11為模板設計引物，該PCR產(chǎn)物大小為7.5K，覆蓋整個基因簇，將此PCR產(chǎn)物連接在pMD18-T載體上。篩選到陽性克隆子后，酶切，將插入片段再與載體pJTU1278相連，構建載體pLMO09403。?

步驟四，使用PCR?Targeting技術，敲除該基因簇中的ximA、ximB、ximC、ximD、ximE，再將突變質粒導入出發(fā)菌株中，敲除相應的基因；?

步驟五，經(jīng)HPLC分析后，ximB、ximC、ximD、ximE突變株發(fā)酵液上清中，該苯并吡喃化合物均消失，而ximA突變株中產(chǎn)生了一個中間代謝產(chǎn)物(廈門霉素B)，從而證實該基因簇為此苯并吡喃化合物的生物合成基因簇；?