[發明專利]一種基于波導束縛的熒光暗場顯微裝置及方法

無效

• 申請號: 201310268658.6
• 申請日: 2013-06-28
• 公開（公告）號: CN103335993A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發明（設計）人: 張斗國;陳漪愷;韓璐;王向賢;王沛;明海
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京科迪生專利代理有限責任公司 11251
• 代理人: 成金玉;顧煒

技術領域

本發明涉及顯微成像的技術領域，特別涉及一種基于波導束縛的熒光暗場顯微裝置及方法。

背景技術

光學顯微鏡作為在顯微成像領域的必備工具，已經廣泛地被相關領域人員應用。其也因為用途不同而分為明場顯微鏡、暗場顯微鏡、相位差顯微鏡、視頻顯微鏡、熒光顯微鏡、偏光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、金相顯微鏡等。尤其的，在部分樣品由于其折射率與周圍環境比較接近情況下，明場下的觀測結果不明顯，因此經常使用暗場顯微成像的方法來觀察。其原理一般是用一些光學元件將照明光源以較大角度（大于收集顯微物鏡的數值孔徑所對應的角度）斜入射到樣品上，只有散射光被物鏡收集成像，可以明顯的表征物體的邊緣輪廓，既看清了其形貌，又凸顯了樣品的對比度。

實現暗場的方法很多，就現有技術來說，一般實現方法都是錐鏡或是光闌等光學元件而制造出中空的光束來實現大角度入射。其主要存在的問題為：（1）透過效率低。由于光闌等光學元件，使遠場激發照明光在入射時候難以全部被利用，造成能量損失。（2）性價比低。利用光學元件組等復雜工藝實現的暗場功能，其由于多個光學元件的加入而造成價格的提升不利于普及。（3）要求苛刻。普通的暗場系統中，由于要很好的濾去照明光需要對光路的準直性有著很嚴格的要求，這不利于成像系統的擴展，不利于本領域技術人員的研究。

發明內容

本發明的技術解決問題：克服現有暗場顯微鏡成像技術的不足，提出一種基于波導束縛的熒光暗場顯微裝置及方法，實現方便易擴展，經濟高效的暗場顯微，解決了傳統遠場激發效率低，光路復雜的技術問題，是一種低成本、實用性強的顯微成像技術。

為實現上述目的，本發明的技術方案如下：一種基于波導束縛的熒光暗場顯微裝置，包括：照明激光光源、擴束透鏡、近端反射鏡、載物芯片、顯微物鏡、遠端反射鏡、濾光片、收集透鏡和CCD圖像傳感器；被觀測樣品置于載物芯片上方；所述載物芯片由玻璃基底層、金屬薄膜層、摻雜熒光分子的聚合物薄膜層由下而上依次構成，用于束縛被激發的熒光，直接實現暗場的功能；所述照明激光光源發出的激光經過擴束透鏡擴束后經近端反射鏡照亮載物芯片，并且激發其聚合物薄膜層中的摻雜熒光分子，熒光分子發出的熒光在上層空氣層與下層金屬薄膜層之間形成導模，并束縛于聚合薄膜層與空氣界面處，當樣品置于載物芯片的上時候，樣品底部靠近載物芯片的處被熒光照亮并散射；散射光直接被顯微物鏡收集，經過遠端反射鏡和濾光片濾去照明激光后，被收集透鏡收集成像于CCD圖像傳感器，實現暗場觀測。

一種基于波導束縛的熒光暗場顯微方法，包括以下步驟：

制樣：制備具有直接實現暗場功能的載物芯片，并且將樣品放于載物芯片上方；所述載物芯片的制備包括為：在玻璃基底上蒸鍍一層金屬薄膜層，再旋涂含熒光分子的PMMA（聚甲基丙烯酸甲酯）構成聚合物薄膜層，烘干后在上方放置樣品，制成載物芯片；

照明：調節照明激光光源，照明激光光源發出的激光經過擴束透鏡擴束后經近端反射鏡照亮載物芯片，并且激發其聚合物薄膜層中的摻雜熒光分子，熒光分子發出的熒光在上層空氣層與下層金屬薄膜層之間形成導模，并束縛于聚合薄膜層與空氣界面處，當樣品置于載物芯片的上時候，樣品底部靠近載物芯片的處被熒光照亮并散射；

觀測：激發熒光由于波導的束縛而無需另外加光學元件去過濾，通過顯微物鏡收集散射光，散射光經過遠端反射鏡和濾光片濾去照明激光后，被收集透鏡收集成像于CCD圖像傳感器，實現暗場觀測。

本發明技術方案的原理為：激發照明光源照亮載物芯片的中的摻雜熒光分子，聚合物薄膜中的熒光分子發出的熒光在上層空氣層與下層金屬層之間形成導模，并束縛于聚合薄膜與空氣界面處而不會被傳播到遠場。僅僅當樣品置于載物芯片的上時候，熒光近場照亮樣品，使其底部靠近載物芯片的處被散射，然后被顯微物鏡收集成像。

本發明和傳統技術相比的優點在于：

（1）結構簡單：無需額外的光學元件來控制激發照明光源的角度，解決了常規暗場顯微系統光路復雜不易擴展的問題；

（2）集成性高，載物芯片同時起到載物，激發熒光近場直接照亮樣品，和屏蔽激發光的作用；

（3）成本低：載物芯片制作簡單易行，擴展性好，成本較低，從而實現了適于研究的新型暗場顯微技術；

（4）操作性好：載物芯片中的聚合物層厚度，都可以實現不同效果的暗場，因而觀測暗場時候可以隨時更換芯片，以適合所需的樣品。

（5）本發明所旋涂的PMMA層在金屬薄膜層的上方既保護了表面使其不易被氧化，又減小了金屬薄膜層的粗糙度，使其更好的束縛被激發的熒光。