[發(fā)明專利]一種用于檢測PRRSV的Taqman Real-time RT-PCR試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310268535.2
• 申請日: 2013-06-29
• 公開（公告）號(hào): CN103305637A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉湘濤;田宏;吳錦艷;陳妍;尚佑軍;尹雙輝;王光祥;張克山;楊順利;劉永杰;宋江偉
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 甘肅省知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)中心 62100
• 代理人: 鮮林

1.一種用于檢測PRRSV的Taqman?Real-time?RT-PCR試劑盒，包含One?Step?RT-PCR?bufferIII、Ex?Taq?HS、PrimerScript?RT?Enzyme?Mix?II、陰性對照，其特征在于：還包含有陽性對照、序列SEQ?ID?NO:1至?SEQ?ID?NO:2的擴(kuò)增引物和序列SEQ?ID?NO:3的探針引物的混合物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測PRRSV的Taqman?Real-time?RT-PCR試劑盒，其特征在于所述序列SEQ?ID?NO:1至?SEQ?ID?NO:2為：

SEQ?ID?NO:1：上游引物CCCGGGTTGAAAAGCCTCGTGT，

SEQ?ID?NO:2：下游引物GGCTTCTCCGGGTTTTTCTTCCTA。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測PRRSV的Taqman?Real-time?RT-PCR試劑盒，其特征在于所述探針引物序列為：

SEQ?ID?NO:3：TGGCAGAAAAGCTGTTAAGCAGGGAGTGGT。

4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種用于檢測PRRSV的Taqman?Real-time?RT-PCR試劑盒，其特征在于所述序列SEQ?ID?NO:1至?SEQ?ID?NO:2的擴(kuò)增引物和序列SEQ?ID?NO:3的探針引物濃度均為10pmol/μL，擴(kuò)增引物及探針引物配比為1:1:1。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種用于檢測PRRSV的Taqman?Real-time?RT-PCR試劑盒，其特征在于所述擴(kuò)增引物擴(kuò)增出的條帶序列為：

序列SEQ?ID?NO:1至SEQ?ID?NO:2的由5’端向3’端延長的序列；

SEQ?ID?NO:4（228bp）：

cccgggttgaaaagcctcgtgttgggtggcagaaaagctgttaagcagggagtggtaaaccttgttaaatatgccaaataacaacggcaagcagcaaaagaaaaagaaggggaatggccagccagtcaatcagctgtgccaaatgctgggtaagatcatcgcccaacaaaaccagtccagaggcaagggaccggggaagaaaaataggaagaaaaacccggagaagcc。

6.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種用于檢測PRRSV的Taqman?Real-time?RT-PCR試劑盒，其特征在于所述探針引物的5’端標(biāo)記物為FAM報(bào)告熒光基團(tuán)、3’端標(biāo)記物為TAMRA淬滅熒光基團(tuán)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測PRRSV的Taqman?Real-time?RT-PCR試劑盒，其特征在于所述陽性對照為構(gòu)建的pMD-228陽性質(zhì)粒，該質(zhì)粒是擴(kuò)增引物SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所擴(kuò)增的豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因序列，長度228bp，克隆至pMD-18T克隆載體，命名為pMD-228。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測PRRSV的Taqman?Real-time?RT-PCR試劑盒，其特征在于所述試劑盒組分的配比為：?

a.?2×One?Step?RT-PCR?bufferIII：25份；

b.?Ex?Taq?HS：1份；

c.?PrimerScript?RT?Enzyme?Mix?II:?1份；

d.引物濃度均為10pmol/μl的三條引物混合液6份，228bp上游引物2份，228bp下游引物2份，探針引物2份；

e.?無RNA酶水13份；

f.?陽性對照pMD-228陽性質(zhì)粒6份；

g.?陰性對照無RNA酶水6份。

9.一種如權(quán)利要求1所述用于檢測PRRSV的Taqman?Real-time?RT-PCR試劑盒的使用方法，其特征在于包括以下步驟：

a．使用權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，條件如下：42℃反轉(zhuǎn)錄5min；94℃預(yù)變性2min；?94℃?20s，退火溫度57℃?30?s，72℃?20?s，40個(gè)循環(huán)；

b.?結(jié)果分析

根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判定：在NTC沒有Ct值的情況下，Ct值<35判為陽性；Ct值介于35-40為可疑，需重復(fù)檢測；再次測定時(shí)該樣品Ct值<35為陽性，Ct值≥35為陰性。