[發明專利]一種副豬嗜血桿菌免疫保護性抗原AfuA

有效

• 申請號: 201310268347.X
• 申請日: 2013-06-28
• 公開（公告）號: CN103319576A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 王春來;李剛;張艷禾;謝芳
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C07K14/285
• 分類號: C07K14/285;C12N15/31;C12N15/70;C12N1/21;A61K39/102;A61K48/00;A61P31/04;C12R1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京市漢信律師事務所 11373
• 代理人: 王文生

技術領域

本發明涉及動物傳染病亞單位疫苗制備技術領域。具體涉及一種副豬嗜血桿菌免疫保護性抗原的鑒定、蛋白基因的分離、克隆以及它編碼的蛋白在疫苗中的應用。

背景技術

現代蛋白質組學技術與傳統免疫雜交方法相結合產生一門新興的交叉學科——免疫蛋白質組學(Immunoproteomic)，并迅速地應用于人、動植物和微生物的免疫原性蛋白研究之中，是一個大規模篩選病原菌抗原強有力的工具。本研究通過雙向電泳和Western?blot技術對副豬嗜血桿菌(Haemophilus?parasuis，Hps)分泌蛋白質組進行分析，篩選出抗原性好、保護力強的抗原蛋白，以期為發展血清學診斷標記及新型亞單位疫苗的研發奠定堅實的基礎。

副豬嗜血桿菌(Haemophilus?parasuis，Hps)是一種革蘭氏陰性菌，常定居于豬的上呼吸道，是一種條件致病菌，能夠導致豬的副豬嗜血桿菌病。在1910年首次報道該菌，因此該病又稱為革拉瑟氏病(?disease)。Hps只感染豬，能夠影響2周齡到4月齡的豬，發病常見于5～8周齡豬。發病率為10％～15％，嚴重時死亡率可達50％，給養豬業帶來巨大損失，該病的主要特征為纖維素性胸膜炎、腹膜炎、關節炎、心包炎和腦膜炎。

本試驗鑒定到具有免疫保護效果的afuA(Iron(Fe³⁺)ABC?superfamily?ATP?binding?cassette?transporter，binding?protein)蛋白，該蛋白屬于ABCtransporters家族，參與三價鐵離子的跨膜轉運，與細菌攝取鐵離子的過程密切相關，ABC(ATP?binding?cassette)transporters家族，是最大的蛋白家族之一，ABC轉運蛋白的核心結構通常由4個結構域組成，包括2個高度疏水的跨膜結構域和2個核昔酸結合域。每一跨膜結構域一般由6個α螺旋構成，也存在由10個、17個、19個α螺旋組成的跨膜結構域。它們形成一個跨膜通道以實現底物分子的跨膜運輸，同時還參與底物的識別過程，大腸桿菌的5％基因組參與編碼該家族的蛋白。其存在于所有物種中，從簡單的微生物到復雜的人類。在微生物中，ABC?transporters與抗生素抗性、抗真菌抗性、營養物質攝取和代謝物排出有關。本試驗鑒定到具有免疫保護效果的afuA蛋白，并對小鼠感染副豬嗜血桿菌能提供有效的免疫保護力，可以作為副豬嗜血桿菌亞單位疫苗開發的候選抗原。

發明內容

本發明的目的是提供能夠用于制備副豬嗜血桿菌病亞單位疫苗的候選抗原的蛋白及其編碼基因。

本研究通過雙向電泳和蛋白印跡法技術對副豬嗜血桿菌(Haemophilus?parasuis，Hps)分泌蛋白質組進行分析，篩選出抗原性好、保護力強的抗原蛋白，以期為發展血清學診斷標記及新型亞單位疫苗的研發奠定堅實的基礎。

本發明鑒定到具有免疫保護效果的AfuA蛋白，并對小鼠感染副豬嗜血桿菌能提供有效的免疫保護力，可以作為副豬嗜血桿菌病亞單位疫苗開發的候選抗原。

為了實現本發明目的，本發明首先分離副豬嗜血桿菌的胞外分泌蛋白，然后通過雙向電泳方法分離分泌蛋白質組，并將其轉移至硝酸纖維素膜上，使用豬的康復血清進行western-blot雜交尋找具有免疫原性的蛋白，然后通過質譜鑒定技術對具有免疫原性的蛋白進行質譜鑒定，再對其編碼基因進行克隆表達，將表達的蛋白純化后，再進行免疫原性分析，同時進行小鼠的免疫保護試驗，結果表明其具有一定的免疫保護作用。

本發明同時保護一種制備AfuA蛋白的方法，所述方法包括培養含有AfuA蛋白編碼序列的重組大腸桿菌，得到AfuA蛋白。所述制備AfuA蛋白的方法具體可為：將所述重組菌37℃培養3h，OD₆₀₀＝0.7時，加入IPTG至終濃度0.8μM，轉至37℃繼續培養4h。

本發明的AfuA蛋白具有免疫保護活性。

本發明的AfuA蛋白可以應用于副豬嗜血桿菌病亞單位疫苗的制備。

更具體地，本發明提供以下各項：

1.一種副豬嗜血桿菌免疫保護性抗原，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

2.編碼根據1所述的副豬嗜血桿菌免疫保護性抗原的核酸，其序列如SEQ?ID?NO：2所示。

3.重組載體，其包含根據2所述的核酸。

4.包含根據2所述的核酸或根據3所述的重組載體的細胞。

5.根據1所述的副豬嗜血桿菌免疫保護性抗原，其用作副豬嗜血桿菌亞單位疫苗。