[發(fā)明專利]一種基于人工細胞的組織工程化組織的構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310264716.8
• 申請日: 2013-06-28
• 公開（公告）號: CN103349795A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉源崗;王士斌;何鵬;林琴;湯曉琳;陳愛政
• 申請（專利權(quán)）人: 華僑大學(xué)
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61L27/20;A61L27/52;A61L27/50
• 代理公司: 泉州市文華專利代理有限公司 35205
• 代理人: 陳雪瑩

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于人工細胞的組織工程化組織的構(gòu)建方法。

【背景技術(shù)】

組織工程是當(dāng)前國內(nèi)外研究的熱點領(lǐng)域，其中如何成功構(gòu)建細胞與支架復(fù)合體以形成組織是組織工程研究中的一個關(guān)鍵問題。

當(dāng)前組織工程組織構(gòu)建的基本思路是先制備支架材料，然后將種子細胞移植到支架材料上，經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)，在體外或體內(nèi)構(gòu)建組織和器官。關(guān)于支架材料研究非常廣泛，各種合成材料、天然生物材料以及復(fù)合材料已經(jīng)廣泛應(yīng)用，而且通過快速成形技術(shù)，已經(jīng)能夠制造出與缺損組織三維結(jié)構(gòu)完全匹配的組織工程支架材料。但是組織構(gòu)建過程中也暴露出一個問題，如何保證細胞在三維支架材料中的分布且生長不受影響？目前采用的基本思路是提高支架的孔隙率和連通率，一些研究者也探討了細胞的植入方式或培養(yǎng)方法對提高細胞的分布及生長繁殖的影響，如采用動態(tài)、磁力、真空、靜電、離心等方式。那么是否可以打破支架制備→注入細胞→培養(yǎng)構(gòu)建這一傳統(tǒng)的組織構(gòu)建方式，嘗試其它有效的構(gòu)建方式來提高細胞的分布生長繁殖呢？可注射水凝膠目前成為研究者的一個熱點，它所采用的構(gòu)建方式是細胞材料混合→制備支架-細胞復(fù)合體→培養(yǎng)構(gòu)建。

此外，研究者也提出了一些新的組織構(gòu)建思路。考慮到支架材料自身降解率、降解產(chǎn)物的毒性、對細胞通訊的影響、對周圍組織的磨損、對細胞形態(tài)的改變等，一些研究者采用了無支架的組織構(gòu)建方式，即細胞→培養(yǎng)構(gòu)建。2007年，美、奧、德的研究者在內(nèi)源性修復(fù)的基礎(chǔ)上，聯(lián)合提出了“促生內(nèi)源性修復(fù)”(Facilitated?endogenous?repair)這一新的組織構(gòu)建方式，其基本策略是采用分子刺激，例如基因轉(zhuǎn)移，利用內(nèi)源性組織自身的再生潛力，促發(fā)原位再生，其構(gòu)建方式為分子刺激→組織再生。最近，自下而上(Bottom-up)的組織構(gòu)建方式也逐漸引起了研究者的興趣。例如Mcguigan等提出了模板組織構(gòu)建的策略，將HepG2細胞與膠原混合固化制成亞毫米模板，模板外表面植有內(nèi)皮細胞，將模板塞入一個大的試管，試管兩端連接微泵系統(tǒng)用于培養(yǎng)液的供給。2005年，Malafaya等提出了一種創(chuàng)新性的組織構(gòu)建方式，利用微球融合作為細胞載體進行組織構(gòu)建。由于微球載體具有較大的比表面積，因而有利于細胞的黏附生長，這一構(gòu)建方式近年來引起了一些研究者的關(guān)注。

由以上可見，研究者在組織構(gòu)建的同時，不斷探索新的組織構(gòu)建的方式，而且取得了一些不錯的效果，但是不同組織構(gòu)建方法之間仍然存在著一些問題，例如，體內(nèi)構(gòu)建的規(guī)模化，微球融合構(gòu)建的低連通率，無支架培養(yǎng)獲得的組織尺寸，水凝膠材料固化對細胞生長空間的影響等等，因此，我們考慮是否可采用這樣一種構(gòu)建方式：參考微球融合的bottom-up構(gòu)建方式，但是細胞是在微球內(nèi)部生長，內(nèi)部環(huán)境為液態(tài)，細胞的生存空間足夠，從而降低組織工程對支架材料孔隙率、連通率的要求。同時考慮到體外組織構(gòu)建成功有可能促進組織工程產(chǎn)品的規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化，因此我們設(shè)計了一種新的組織工程構(gòu)建方式：結(jié)合水凝膠與bottom-up的概念，利用“人工細胞”為基元體外構(gòu)建組織。

【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題，在于提供一種基于人工細胞的組織工程化組織的構(gòu)建方法，能夠降低傳統(tǒng)支架對高孔隙率及高連通率的要求，且制備方法簡單，有利于實現(xiàn)體外構(gòu)建的大規(guī)模生產(chǎn)。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：

一種基于人工細胞的組織工程化組織的構(gòu)建方法，所述方法步驟如下：

步驟10、將細胞懸液浮于過濾除菌的海藻酸鈉溶液中，并通過滴液發(fā)生裝置滴入氯化鈣溶液中，形成海藻酸鈣膠珠；

步驟20、將用生理鹽水清洗過后的膠珠置于含膜材的溶液中，使膠珠表面覆上一層膜，形成微膠囊；再將微膠囊表面多余的正電荷進行中和；

步驟30、采用檸檬酸鈉溶液使微膠囊內(nèi)的海藻酸鈣膠珠液化，即形成人工細胞；再將人工細胞和水凝膠的混合物固化成型，最后形成以人工細胞為基本結(jié)構(gòu)單元，水凝膠為填充介質(zhì)的人工細胞-水凝膠復(fù)合體；

步驟40、將人工細胞-水凝膠復(fù)合體置于靜態(tài)或振蕩或微重力的條件下培養(yǎng)，以構(gòu)建組織工程化組織。

進一步地，所述步驟30還可以為：將微膠囊與水凝膠的混合物固化成型后，加入檸檬酸鈉，使微膠囊內(nèi)的海藻酸鈣膠珠液化，最后形成以人工細胞為基本結(jié)構(gòu)單元、水凝膠為填充介質(zhì)的人工細胞-水凝膠復(fù)合體。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

第一、由于生物微膠囊(即人工細胞)及水凝膠通透性較好，降低了傳統(tǒng)支架對高孔隙率及高連通率的要求；