[發(fā)明專利]哈維氏弧菌巨噬菌體VP4B及其應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310263942.4
• 申請(qǐng)日: 2013-06-28
• 公開（公告）號(hào): CN103555671A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 駱祝華;葉德贊;于艷萍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 國(guó)家海洋局第三海洋研究所
• 主分類號(hào): C12N7/00
• 分類號(hào): C12N7/00;C12N1/21;A61K35/76;A61P31/04;C12R1/63
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是巨噬菌體及其應(yīng)用。?

背景技術(shù)：

細(xì)菌性感染是感染疾病中最常見的類型，過去幾十年里抗生素被認(rèn)為是治療細(xì)菌感染的最好方法。但是隨著近年來抗生素濫用現(xiàn)象日益嚴(yán)重，細(xì)菌的耐藥性問題日益加劇，人們把選擇其他抗菌劑的目光轉(zhuǎn)移到噬菌體上。相較傳統(tǒng)的抗生素，噬菌體的優(yōu)勢(shì)在于對(duì)宿主菌有高度專一性，能夠持續(xù)自我繁殖，對(duì)抗藥菌株具有再侵染能力，對(duì)環(huán)境沒有污染，無刺激。?

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，噬菌體的地位越來越重要。對(duì)噬菌體的基因進(jìn)行研究，不僅為噬菌體的多樣性和進(jìn)化途徑提供了資源，也為噬菌體的生物學(xué)特性和其與宿主之間的相互作用提供了證據(jù)，同時(shí)也為噬菌體治療的安全性和可控性提供了保障。?

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的在于提供一種巨噬菌體VP4B及其應(yīng)用。?

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人利用雙層平板分離純化、基因組提取和核酸序列測(cè)定等技術(shù)對(duì)從環(huán)境中得到噬菌體VP4B，對(duì)其進(jìn)行基因組核酸序列的測(cè)定和分析，發(fā)現(xiàn)其基因組序列全長(zhǎng)246,964bp，?GC含量為43.29％，含有210個(gè)預(yù)測(cè)的ORF。發(fā)明人于2013年5月9日將該噬菌體保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址：湖北武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心)，保藏號(hào)CCTCC?NO：M2013192，其分類命名為哈維氏弧菌噬菌體VP4B(Vibrio?harveyi?Phage?VP4B)。?

本發(fā)明的巨噬菌體VP4B可用于噬菌體功能基因組學(xué)、新型病毒載體構(gòu)建、進(jìn)行弧菌病害的預(yù)防和快速診斷，以及噬菌體吸附、侵染、裂解弧菌機(jī)制的研究。?

根據(jù)后面的實(shí)施例，本發(fā)明中的巨噬菌體VP4B是裂解性噬菌體，能夠侵染哈維氏弧菌，在弧菌體內(nèi)復(fù)制增殖之后，能夠裂解哈維氏弧菌的細(xì)胞壁，致使弧菌裂解死亡。可以有效的控制哈維氏弧菌的數(shù)量及增殖速度，可以用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中哈維氏弧菌病害的防治。在具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的巨噬菌體VP4B能夠明顯的抑制哈維氏弧菌生長(zhǎng)速度和濃度。?

本發(fā)明可以根據(jù)巨噬菌體的抑菌曲線來對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的弧菌，特別是哈維氏弧菌，進(jìn)行病害防治以及病害防治酶材料的開發(fā)應(yīng)用。?

本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的巨噬菌體的細(xì)菌。優(yōu)選地，所述細(xì)菌是哈維氏弧菌。?

本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生巨噬菌體的方法，所述方法包括在細(xì)菌中培養(yǎng)本發(fā)明的巨噬菌體的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)菌是哈維氏弧菌，例如德國(guó)微生物菌種保藏中心以保藏號(hào)：DSM-6904保藏的細(xì)菌。?

附圖說明：

圖1為哈維氏巨噬菌體VP4B抑制哈維氏弧菌生長(zhǎng)OD曲線圖。?

具體實(shí)施方式：

1.噬菌體的收集和濃縮?

(1)向200mL液體2216E培養(yǎng)基(1g酵母粉，5g蛋白胨，0.01g磷酸高鐵，1L陳海水)的三角瓶中添加0.1mL哈維氏弧菌(購自DSMZ，保藏號(hào)：DSM-6904)溶液，并向所述三角瓶中添加0.1mL本發(fā)明的哈維氏巨噬菌體VP4B(保藏號(hào)：CCTCC?NO：M2013192)溶液，置于37℃培養(yǎng)箱，搖瓶培養(yǎng)18小時(shí)。向培養(yǎng)后的液體中加入酶抑制劑苯甲基磺酰氟PMSF使其終濃度為1mM，以15000×g進(jìn)行20min的離心。?

(2)取上清加入NaCl，使其終濃度為1M；加入聚乙二醇PEG6000(Sigma，25322-68-3)，使其終濃度為10％，在4℃下放置1-3h。?

(3)以15000×g在4℃下離心1h。?

(4)去上清，用2mL的SM緩沖液(Amrecso，J614-500ML)重懸，以3000×g進(jìn)行15min離心，去沉淀。?

(5)將離心上清液在氯化銫溶液(1.5g/mL)中，以220000×g在4℃下離心24h。?

(6)用一次性針筒收集噬菌體。?

2.噬菌體基因組的提取?

(1)在上述步驟1中制備的1mL噬菌體顆粒懸浮液中加入?DNase/RNase混合物(Takara，2210CA/R0675)(終濃度為2mL/L)，混合均勻，在37℃的水浴中孵浴45min。?

(2)加入150μL?TE緩沖液(10mM?Tris-HCl，1mM?EDTA，pH＝8.0)和30μL10％(w/v)SDS溶液，上下顛倒，在70℃的水浴中孵育10min。?

(3)加入125μL乙酸-乙酸鉀緩沖液(pH4.3)，在冰水浴中孵育30min-1h。?

(4)以14,000×g在4℃下離心15min。?