[發(fā)明專利]提取發(fā)酵床墊料細(xì)菌總DNA的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310256759.1
• 申請日: 2013-06-26
• 公開（公告）號: CN103773755A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李婧;顏培實
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提取發(fā)酵床墊料中細(xì)菌總DNA的方法，屬于提取細(xì)菌總DNA領(lǐng)域，專用于發(fā)酵床墊料中細(xì)菌總DNA的提取。

鹽酸硫胺素(Thiamine?hydrochloride)，化學(xué)名稱為3-[(4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基)-甲基]-5-(2-羥基乙基)-4-甲基噻唑；其他名稱：維生素B1；分子式：C₂₄H₃₄Cl₄N₈O₂S₂；分子量：672.5223；儲存條件：2-8℃；溶解度H₂O：0.1g/mL?at20℃，clear，colorless；水溶解性：1g/mL；熔點：246-254℃。

發(fā)酵床養(yǎng)豬是在舍內(nèi)鋪設(shè)厚墊料，同時進行飼育和糞尿處理的飼養(yǎng)方式，利用土、木屑、牛糞、豬糞、青草及其所含微生物形成的自然發(fā)酵床，原生態(tài)為自然發(fā)酵床的理念之一，即利用糞便中的微生物降解糞便有機物。發(fā)酵床的墊料種類多樣，木屑因其吸水性好，且木質(zhì)素很難被分解，成為發(fā)酵床墊料的首選素材，稻草、麥秸、玉米秸粉、甘薯藤粉、甘蔗渣和樹林落葉也可作為替代材料。木屑和其他秸稈材料的組合也是可行的，不僅是資源替代，也擴大免費菌種來源，綜上所述，發(fā)酵床墊料組成復(fù)雜，提取發(fā)酵床墊料細(xì)菌總DNA有別于提取植物、動物組織與微生物的方法。

發(fā)酵床成分復(fù)雜，類似于土壤又不同于土壤，研究顯示，土壤成分復(fù)雜，常規(guī)提取總DNA的方法難以去除腐植酸，微量的腐植酸可抑制PCR擴增中的Taq?DNA聚合酶以及酶切反應(yīng)的限制性內(nèi)切酶活性，此外，不同發(fā)酵床墊料成分也會影響微生物DNA的提取效果。

背景技術(shù)

發(fā)酵床墊料成分復(fù)雜，采用傳統(tǒng)的Genoise?Bacteria?DNA?Ectracetion?Kit方法(簡稱試劑盒法)以及Zoetendal方法(即CTAB方法)提取出的細(xì)菌總DNA，應(yīng)用大腸桿菌引物不能擴增出對應(yīng)條帶，即不能應(yīng)用于PCR技術(shù)，影響發(fā)酵床墊料中后續(xù)分子生物學(xué)研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提取發(fā)酵床墊料中細(xì)菌總DNA的方法，目的是去除影響PCR的抑制因子，提取純凈的細(xì)菌總DNA，其鹽酸硫胺素最適含量為1mol/L。

本發(fā)明所提供的發(fā)酵床墊料中細(xì)菌總DNA提取方法，是將傳統(tǒng)的Genoise?Bacteria?DNAEctracetion?Kit方法以及Zoetendal方法進行改進，即添加鹽酸硫胺素，其中試劑盒改進方法具體步驟如下：

將發(fā)酵床樣本置于盛有PBS溶液離心管中，離心后提取上清液，在新的離心管中加入0.5～2M0.3V/V的鹽酸硫胺素溶液，添加Genoise?Bacteria?DNA?Ectracetion?Kit1號液和Protein?K，震蕩混勻，水浴后放于冰上冷卻至室溫，加入Genoise?Bacteria?DNA?Ectracetion?Kit2號液，劇烈震蕩后將離心管放在冰袋上冷卻至室溫，室溫下離心，棄固形物取上清液，轉(zhuǎn)移到新的離心管中，重復(fù)離心步驟直至無固形物可見，在離心液中加入異丙醇，上下顛倒混勻，室溫下培養(yǎng)，離心，棄上清，向新的離心管中加入乙醇，上下顛倒數(shù)次以清洗DNA團塊，室溫下離心，棄上清，風(fēng)干5min以內(nèi)。加入Genoise?Bacteria?DNA?Ectracetion?Kit3號液，移液槍混勻，室溫下培養(yǎng)。最后Nanodrop2000紫外分光光度儀測定核酸濃度，蛋白污染和酚污染。

Zoetendal改進方法如下：將發(fā)酵床樣本放于盛有CTAB離心管中，震蕩混勻，離心后提取上清液，加0.3v/v0.5～2M鹽酸硫胺素溶液并放于冰上冷卻置室溫，離心后轉(zhuǎn)移上清，加入RNase，37℃水浴。加入氯仿∶酚∶異戊醇溶液，震蕩至溶液呈乳白色混濁狀態(tài)。離心后取上清液，重復(fù)離心步驟，直至全界面清晰無固形物，加入異丙醇，震蕩混勻，放置至室溫，離心后小心棄去上清液，加入乙醇后震蕩混勻，將白色液體輕輕彈起，離心后小心棄去上清液。加TE?buffer，震蕩，最后用Nanodrop2000測定核酸濃度，蛋白污染和酚污染。

本發(fā)明所提供的發(fā)酵床墊料細(xì)菌總DNA提取方法，其優(yōu)點和效果為：加入了鹽酸硫胺素，能夠提取發(fā)酵床墊料中細(xì)菌總DNA，并且消除了PCR抑制因子的干擾，使PCR、Real-Time?PCR技術(shù)順利進行。

附圖說明

圖1為試劑盒方法提取發(fā)酵床墊料細(xì)菌總DNA的瓊脂糖電泳圖譜。

圖2為試劑盒方法提取發(fā)酵床墊料細(xì)菌總DNA應(yīng)用大腸桿菌引物進行PCR后的瓊脂糖電泳圖譜。