[發明專利]一株耐熱氨肽酶的產生菌及該酶的純化方法

無效

• 申請號: 201310253385.8
• 申請日: 2013-06-25
• 公開（公告）號: CN103361287A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 田亞平;吳延濤;周楠迪
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/48;C12R1/385
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一株耐熱氨肽酶的產生菌及該酶的純化方法與主要酶學特征，該種耐熱氨肽酶，屬于與食品質量提升相關的外切型蛋白酶類及酶學特征研究領域。

背景技術

氨肽酶（aminopeptidase，簡稱AP，EC?3.4.11）是一類從多肽鏈的N端順序水解氨基酸、使氨基酸逐個游離出來的酶。氨肽酶的酶解產物為小肽和游離氨基酸，因此它們可切除苦味肽氨端的疏水氨基酸，從而脫除苦味。其廣泛用于肉制品加工、乳品業等，減少苦味、增加游離氨基酸，提高食品營養價值；并且氨肽酶還可用作蛋白序列測定的分子工具及重組蛋白或融合產物的固化劑等。

本發明的耐熱氨肽酶具有提高反應速率、簡化工藝、降低成本、提高產品質量和耐貯藏等優點。所以該耐熱氨肽酶對于氨肽酶應用于生物活性多肽的制備、工業生產等方面的研究具有較深遠的意義，且對提高我國相關產業的加工水平，降低成本，增強行業競爭力，打破這種壟斷局面具有重要的作用。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的特點，提供一種新的能產耐熱氨肽酶的銅綠假單胞桿菌NJ-814。

本發明目的是提供銅綠假單胞桿菌NJ-814發酵產氨肽酶的特點、酶的純化方法、酶的底物特異性及酶學性質。

本發明的技術方案：一株耐熱氨肽酶產生菌，其被鑒定分類命名為銅綠假單胞桿菌（Pseudomonas?aeruginosa?）NJ-814，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：CGMCC?No.7638。

用所述菌株制備耐熱氨肽酶的純化方法，出發菌株為銅綠假單胞桿菌（Pseudomonas?aeruginosa）NJ-814，即CGMCC?NO.7638，經過搖瓶發酵，離心獲得的粗酶液，通過硫酸銨鹽析和DEAE陰離子交換層析分離純化，經SDS-PAGE檢測獲得電泳純的耐熱氨肽酶。

純化所得到的耐熱氨肽酶，其最適反應溫度為80℃；在50℃或60℃保溫120?min后，相對酶活仍高于80％；在70℃保溫120?min相對酶活保留70％；在80℃處理120?min的相對酶活仍保留49.78%，即此溫度下半衰期為119?min；最適反應pH為9.0；pH穩定范圍為7.5-10.5；對Lys-pNA、Arg-pNA、Leu-pNA作為底物均有一定的分解作用，其中對Lys-pNA的分解能力強。

A?粗酶液的制備及純化

經過搖瓶發酵，離心獲得的粗酶液，將上述粗酶液經硫酸銨鹽析，收集沉淀并溶解于少量pH8.5?50?mmol/L?Tris-HCl緩沖液中得酶液A。經過Hiprep?DEAE?16/10?FastFlow陰離子交換層析，收集活性峰，得到酶液B。經SDS-PAGE檢測酶液B已達到電泳純。

B?酶學性質（見圖1-6）

（1）酶最適反應溫度：將氨肽酶置于不同溫度下（30-90℃）與底物發生反應，測定酶活力，結果見圖1，酶的最適反應溫度為80℃，在50-90℃之間均具有較高的催化能力。

（2）酶的熱穩定性：將酶液置于不同的溫度（50、60、70、80℃）保溫120?min，每20?min取樣測定酶活；在90℃選擇分別保溫5?min、10?min；均立即在0℃冰浴中冷卻，將最高的酶活力定義為100％。結果見圖2，該菌所產氨肽酶在50℃和60℃條件下相對穩定，保溫120?min后，相對酶活仍高于80％；70℃，120?min相對酶活保留約70％；80℃，120?min的相對酶活仍保留49.78%，即此溫度下該酶半衰期為119?min；90℃保溫時，相對酶活保留率急劇下降，保溫10?min后，相對酶活僅為19.87%。綜上說明該菌所產的氨肽酶的溫度穩定性較好，穩定范圍為80℃以下。

（3）酶的最適反應pH：分析是在50?mmol/L的不同pH緩沖體系（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5）。其中PBS緩沖溶液（pH?6.0-7.5）、Tris-HCl緩沖溶液（pH?7.5-9.0）、Glycine-NaOH緩沖溶液（pH?9.0-10.5）。結果見圖3，該氨肽酶的最適反應pH為9.0。在pH?7.5-9.5之間反應的酶活也較高。