[發明專利]鑒定龍須菜981良種的特異性探針及其應用

有效

• 申請號: 201310243064.X
• 申請日: 2013-06-08
• 公開（公告）號: CN103397083A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發明（設計）人: 隋正紅;王津果;周偉;常連鵬;張淑
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及海洋藻類的優良品系鑒定，特別涉及鑒定龍須菜981良種的特異性探針及其應用。

背景技術

紅藻龍須菜是重要的產瓊膠海藻，目前，經青島湛山灣野生種群選育而來的龍須菜981良種具有生長快速，分支多，耐高溫，速生抗逆，瓊膠含量高且好，已在福建南部海區、廣東省汕頭市南澳島等地栽培多年，并在廣東、福建、浙江、山東及遼寧沿海建立了龍須菜栽培產業，但其與野生龍須菜在外觀形態上難以區分，之前都是通過測定二者的生長性狀和生理生化指標來加以區別的的。本發明提供兩段核酸序列及其應用，采用該技術可快速、準確鑒定981良種，解決龍須菜在栽培過程中產生的種苗混雜現象，避免對龍須菜栽培產業造成重大損失。

通過測定并測量生長性狀和生理生化指標來加以區別，試驗周期長，操作繁瑣。本發明提供兩段核酸序列，可快速、準確鑒定981良種，解決龍須菜在栽培過程中產生的種苗混雜現象，避免對龍須菜栽培產業造成重大損失。

發明內容

針對現有技術中存在的缺陷，本發明的目的在于提供兩條探針，可快速、準確鑒定龍須菜981良種，解決龍須菜在栽培過程中產生的種苗混雜現象，避免對龍須菜栽培產業造成重大損失。

本發明提供的鑒定龍須菜981良種的特異探針，所述的特異性探針序列為：

具有序列為SEQ?ID?NO：1或SEQ?ID?NO：2的核苷酸序列；

在上述方案的基礎上，所述探針由地高辛標記試劑盒進行標記。

上述鑒定龍須菜981良種的特異性探針用于龍須菜981良種的鑒定。

利用上述特異性探針鑒定龍須菜981良種的方法，使用southern印跡雜交的方法進行鑒定。

上述鑒定龍須菜981良種的方法的具體步驟如下：

(1)提取龍須菜基因組DNA；

使用CTAB法提取龍須菜基因組DNA；

(2)基因組DNA的限制酶切；

采用EcoR?I、EcoR?V和EcoR?V、Hind?III兩對酶切組合分別對步驟(1)所得到的龍須菜基因組DNA進行酶切；

(3)Southern?Blot；

將凝膠放入培養皿中，加入20ml變性液，搖動變性1h，傾去變性液，用蒸餾水漂洗一次；換中和液20ml，搖動1h，之間更換一次中和液；在電泳槽內加適量轉移液20×SSC，中間支架放一濾紙條，濾紙兩端浸沒在20×SSC中，取出中和的凝膠，點樣孔朝下倒扣于濾紙上，用玻璃棒滾動去除膠與濾紙的氣泡，將與膠大小相同的尼龍膜放在無菌蒸餾水表面，使之自然吸水下沉，將膜轉入20×SSC中浸泡5min，蓋在凝膠上面；將兩張與膜大小相同的濾紙置2×SSC溶液中濕潤，蓋在膜上，排除氣泡，濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，吸水紙上壓0.5-1kg重物，轉移12h。轉移后，在膜上做標記，明確膜的正反，紫外檢測凝膠轉移效果，膜自然晾干，在2×SSC溶液中浸潤，120℃烘烤30min；

(4)膜的預雜交、雜交；

添加37-42℃預熱的DigEasyHyb5ml，封膜，預雜交30min，探針100℃5min變性后迅速置于0℃，傾去預雜交液，重新添加2ml預雜交液以及10ng變性標記探針，封膜，42℃雜交過夜，雜交完成后倒出雜交液，將膜放入小燒杯中加8ml的2XSSC，0.1％SDS，室溫洗滌5min，重復一次，倒出洗膜液，加8ml的0.5XSSC，0.1％SDS，65℃洗滌15min，重復一次；

(5)顯色；

膜于小燒杯中加5ml緩沖液I，洗滌5min，倒去緩沖液I，加10ml緩沖液II，室溫放置30min，再倒去緩沖液II，膜置于培養皿內，添加10ml緩沖液II，室溫30min，將膜取出置于小燒杯中，加50ml緩沖液I，洗滌15min，重復一次，倒去緩沖液I，加緩沖液III10ml，放置5min，傾去緩沖液III，加5ml顯色液，置于暗中靜止待顯色，顯色結束取出膜加3ml蒸餾水，洗滌5min，空氣干燥；

(6)結果觀察；

龍須菜樣品的酶切基因組DNA片段與探針雜交結果顯示：龍須菜981良種在600bp、500bp左右位置出現了條帶，而其他品系個體中均無條帶出現。

本發明所述的兩條特異性探針，可以快速而準確地鑒定龍須菜981良種。

附圖說明：

圖1龍須菜樣品的酶切基因組DNA片段與SEQ?ID?NO：1探針雜交結果顯示；