[發明專利]一種大規模哺乳動物工程細胞培養方法

有效

• 申請號: 201310239477.0
• 申請日: 2013-06-17
• 公開（公告）號: CN103320390A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 周凱松;王慶民;孫麗霞;曹平;夏庭坤;崔午陽
• 申請（專利權）人: 齊魯制藥有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/02
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

技術領域

本發明涉及一種能夠應用于工業化的大規模工程細胞培養方法，屬于生物技術領域。

背景技術

目前用于制備基因工程藥物的表達系統包括原核表達系統和真核表達系統。原核表達系統主要指大腸桿菌表達系統，它具有表達水平高、操作簡單、周期短、易于大規模高密度培養、成本低等優點，往往成為表達抗體片段以及表達產物翻譯后修飾的又不影響功能和活性的蛋白類藥物的首選表達系統。但對于抗體和糖蛋白類生物藥物來說，表達產物多肽鏈的折疊、二硫鍵的形成、糖基化的有無、以及糖基化的類型常常影響表達產物的合成、分泌、生物活性、體內穩定性以及免疫原性等特性；而原核細胞缺少內質網和高爾基體等可用于進行糖基化的結構和機制，所表達的產物是非糖基化的，且常常以包涵體的形式存在，因此大腸桿菌表達系統不適于表達全抗體和糖蛋白類藥物。真核表達系統包括酵母表達系統、昆蟲及植物、哺乳動物細胞【如中國倉鼠卵巢（CHO）細胞】等真核細胞表達系統。其中酵母、昆蟲及植物等真核細胞雖能進行糖基化，但其糖基化的方式與人類等哺乳動物細胞糖基化的方式是不一樣的。與其它真核細胞表達系統相比，目的基因在哺乳動物細胞中表達的蛋白與天然蛋白的結構、糖基化類型和方式幾乎相同且能正確組裝成多亞基蛋白，并且哺乳動物細胞能以懸浮培養或在無血清的培養基中達到高密度且培養體積能達到2000L以上，因此在表達這一類蛋白藥物時人們往往首選哺乳動物細胞表達系統。與大腸桿菌表達系統相比，哺乳動物細胞的表達水平低、獲得高表達細胞株所需的時間長、細胞大規模培養的成本高等導致哺乳動物細胞生產的蛋白質類藥物的成本較高，因此建立哺乳動物細胞高效表達系統以及高表達工程細胞株的獲得，是基因工程藥物研究和生產的瓶頸，參見張國強等，生物技術通訊，Vol.16N0.1Jan.,2005。

近年來，為了提高蛋白質類藥物的表達水平、降低生產成本，主要從表達載體的構建、宿主細胞的馴化、培養工藝的優化三方面對哺乳動物細胞表達進行優化。通過降低目的基因的位置效應、提高目的基因的轉錄和翻譯水平以及目的基因的拷貝數等方面構建哺乳動物細胞高效表達載體，與此同時，研究者也對宿主細胞進行了多方面的改造，使之能更好地適應工業化大規模培養的要求，從而降低細胞培養和產品純化的成本。

在細胞工藝優化方面，當前哺乳動物細胞培養工藝中占有主流優勢的是懸浮細胞培養工藝。典型的懸浮細胞培養工藝包括細胞復蘇、擴培和生產。一般從復蘇工作細胞庫細胞開始，經過不同規模的細胞培養罐逐級擴培，轉入生產細胞罐，在生產罐中繼續生長和表達產品。為了提高產量，通常需要在細胞罐中維持高密度和高活力的細胞。補料分批培養和灌注連續培養是經常用到的兩種細胞培養工藝，補料分批培養工藝是間歇或連續向細胞罐內添加濃縮的培養基或營養成分，直至批次培養結束對產物進行收集純化，工藝規模容易放大，操作簡便，具有較高的體積產率。典型的補料分批培養工藝中，擴培罐中的培養時間一般為2-3天，生產細胞罐的培養時間一般在15天左右。生產罐中培養的15天中，擴培罐處于閑置狀態，漫長的生產罐培養時間是影響設備使用率、影響生產周期的限制性步驟，同時較長的生產周期也大大增大了污染的風險，增大了生產操作的壓力。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供一種能夠應用于工業化的大規模動物工程細胞培養方法，解決了細胞培養工藝過程中培養時間長、設備利用率低、易污染等技術難題。

術語說明：

本發明將進入生產罐之前的培養罐定義為擴培罐；擴培是細胞擴大培養的通用簡稱；

5%CO₂：是指CO₂體積濃度為5%；

溶氧（DO）%：是指體系中氧的溶量體積比；

CD?Forti?CHO培養基：是一種商品化的基礎培養基的名稱；

CD?CHO培養基：是一種化學成分確定的無蛋白培養基，適合懸浮培養的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的生長和重組蛋白的表達；

補料培養基Feed?C：是一種商品化的補料培養基的名稱；

L-Gln：L-谷氨酸酰胺；MTX：氨甲喋呤；

G418：一種氨基糖苷類抗生素,在分子遺傳試驗中，是穩定轉染最常用的抗性篩選試劑。

細胞對數生長期：指細胞在一定的環境下經過了短暫的適應期，進而快速生長的時期，此時期營養充足，細胞會以對數生長，N為細胞的分裂次數，細胞以2的N次方的速度生長(假如原來只有一個細胞，進入對數期以后就會變為兩個，兩個再變為四個)。