[發明專利]檢測抗丙型肝炎病毒編碼的非結構蛋白NS3和NS5的天然雙特異性抗體的試劑盒

無效

• 申請號: 201310231292.5
• 申請日: 2013-06-09
• 公開（公告）號: CN103308697A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 李金明;林貴高;王露楠;張瑞;張括;孫宇;謝潔紅;李文麗;樊高威
• 申請（專利權）人: 衛生部北京醫院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/543
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 趙曉丹

技術領域

本發明涉及一種檢測抗丙型肝炎病毒編碼的非結構蛋白NS3和NS5的天然雙特異性抗體的試劑盒，屬于臨床檢驗學領域。

背景技術

通常所描述的一個抗體（antibody）分子具有兩個相同的抗原結合區域（Fab），只能識別一種抗原。雙特異性抗體（bispecific?antibody）是一類具有雙功能的抗體分子，其兩個Fab段具有不同的特異性，能與不同的抗原分子結合。目前應用于醫學領域的雙特異性抗體均是通過人工改造相應的單特異性抗體而獲得。荷蘭Schuurman等人首次報道了一種存在于人體內的天然雙特異性抗體―IgG4。報道稱，他們成功證實了分離的IgG4組分具有結合兩種不同過敏原的特性。他們對IgG4的雙特異性作出如下推斷：IgG4在體內是動態性分子，一種特異性的IgG4半分子（一條輕鏈連同相應的重鏈）可以與另一種特異性的IgG4半分子發生交換，由此產生的雜交分子即具有同時結合兩種抗原的特性。

天然的雙特異性抗體可能普遍存在于長期受免疫原刺激的疾病，例如自身免疫疾病，細菌、病毒或者寄生蟲感染，以及慢性腫瘤生長等過程。丙型肝炎病毒（HCV）感染是一種病毒在宿主肝細胞內不斷復制的慢性感染過程，通常不能被治愈。HCV編碼4個結構蛋白（core,E1,E2,ion?channel?p7）和6個非結構蛋白（NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A,和NS5B。研究表明，HCV編碼的core,NS3,NS4B和NS5A是慢性丙型肝炎感染中引起體液免疫應答的主要抗原。慢性丙型肝炎病人血清中極有可能存在針對HCV病毒不同抗原的天然雙特異性抗體。

發明內容

本發明要解決的第一個技術問題是提供一種檢測HCV編碼的NS3和NS5雙特異性抗體的試劑盒。該試劑盒基于酶聯免疫吸附檢測技術，利用雙抗原夾心法，包括HCV?NS3和NS5兩種抗原，可以檢測存在于丙型肝炎患者血清中的一種天然雙特異性抗體，所述的雙特異性抗體可同時結合HCV?NS3和NS5兩種抗原，是丙型肝炎檢測的一項新型指標。

本發明要解決的第二個技術問題是提供檢測抗HCV?NS3和NS5雙特異性抗體的試劑盒在檢測丙型肝炎患者血清中抗HCV?NS3和NS5雙特異性抗體的應用。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

本發明提供了一種檢測抗HCV?NS3和NS5雙特異性抗體的試劑盒，包括：NS3包被的微孔板、生物素標記的NS5（NS5-biotin）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）、稀釋液、陽性對照液、陰性對照液、底物液、洗滌液和終止液。

本發明所述的NS3和NS5兩種抗原包括但不限于已經公開報道的，和根據已公開的NS3序列（Genbank:ADN30215.1）和NS5序列（Genbank:AAQ85803.1）利用現有技術手段制備的重組蛋白或合成的多肽。優選地，本發明所述的NS3為重組蛋白，其氨基酸序列為序列表SEQ?ID?No.1所示，所述的NS5為合成多肽，其氨基酸序列為序列表SEQ?ID?No.2所示。

所述Streptavidin-HRP購自Thermo?Fisher?Scientific公司。

所述試劑盒中的稀釋液為含20%（v/v）小牛血清的磷酸鹽緩沖液，洗滌液為含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，底物液為3′,3′,5′,5′,-四甲基聯苯胺（TMB），所述終止液為0.5M硫酸。

所述陽性對照液為已確定雙特異性抗體為陽性的丙型肝炎患者血清，陰性對照液為健康人血清。

利用本發明所述的試劑盒檢測抗NS3和抗NS5雙特異性抗體的方法為：

（1）包被有NS3的微孔板捕獲血清樣本中具有NS3反應性的抗體；

（2）加入生物素標記的NS5結合具有抗NS3和抗NS5雙特異性的抗體。

（3）加入HRP標記的鏈霉親和素檢測具有抗NS3和抗NS5雙特異性的抗體。

本發明人采用NS3包被微孔板作為固相抗原，經與血清樣本溫育后，加入生物素標記的NS5結合具有抗NS3和抗NS5雙特異性的抗體，最后加入HRP標記的鏈霉親和素檢測檢測捕獲的雙特異性抗體。使用PIERCE公司的Sulfo-NHS-LC-Biotinylation?Kit試劑盒將NS5生物素化，用丙型肝炎抗體陽性血清對NS5-biotin進行稀釋度測定，確定的最佳稀釋度用于雙特異性抗體的測定。

本發明的優點：