[發明專利]MiR-17，miR-20a，miR-29c和miR-223作為鼻咽癌分子標志物的應用

在審

• 申請號: 201310224968.8
• 申請日: 2013-06-07
• 公開（公告）號: CN104232741A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 李桂源;彭淑平;曾希;李夏雨;牛蔓;韋娉嬪
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/113
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及腫瘤分子標志物，特別涉及微小RNA在鼻咽癌高危人群篩查和早期診斷中的應用。

技術背景

鼻咽癌具有明顯的地域和種族分布特征，我國是鼻咽癌的高發區，特別是在我國南方地區，據統計，男性鼻咽癌發病率15～50/10萬，排在惡性腫瘤第三位，臺灣也是鼻咽癌的高發區，其發病率男女分別為8.3/10萬和3.5/10萬，而在歐美等西方國家，鼻咽癌罕見，鼻咽癌也被形象的稱為“中國癌”。鼻咽癌發病隱秘，早期沒有明顯臨床表現，不容易發現，且鼻咽癌淋巴結轉移發生早。因此，鼻咽癌早期診斷相當困難。目前，臨床上針對鼻咽癌的篩查主要是檢測血液中EB病毒感染情況，如EBV-DNA、EBV-VCA-IgA等。但鼻咽癌與EBV并非完全相關，且許多疾病(如淋巴瘤、胃癌、乳腺癌、咽炎、傳染性單核細胞增多癥等)都可伴有EBV感染，健康人群也有一定比例感染者，大量的臨床實踐證明，EBV相關檢測診斷鼻咽癌的靈敏度與特異性都不高，達不到作為早期診斷標志物的要求。良好的分子標記物篩選方法，應當是創傷小而重復性好，此外，篩選技術應足夠靈敏，既可檢測出早期癌癥，又可準確地將未患癌癥者進行區分。因此，最為理想的是通過簡單的血樣檢測即可檢測出腫瘤組織特異性分子。

血液在人體各個組織和器官中循環，并與周圍的內環境發生著密切的物質、營養和信息交換，機體的生理及病理變化都會被“記錄”在血液內，血液天然的反映著機體各個部位的生理和病理狀態。在疾病發生發展過程中，血液中相關成分的改變往往早于形態學的改變。而且，血液樣品具有容易獲取、基本無創的獨特優勢，是理想的臨床檢測材料。因此，血液是腫瘤標志物篩選的理想材料，疾病血液標志物也是最方便臨床直接應用的研究成果。

多個研究小組也報道了在血清和血漿中存在大致等量的微RNA。由于這些血漿/血清微RNA存在于血液循環內，因此稱作循環微RNA。循環微RNA十分穩定，其穩定性遠遠高于循環mRNA。循環微RNA不容易被血液內源性和外源性RNases降解，在室溫下放置24h和反復凍融8～10次后，其中的微RNA量沒有明顯變化，并且還能耐受較酸和較堿的環境。有人認為可能是因為其與某些蛋白結合或包裹在囊泡內而得到保護。此外，不同健康個體的血清和血漿微RNA表達水平相當一致，沒有明顯個體差異，而腫瘤能明顯影響血清和血漿中微RNA的表達。循環微RNA的穩定性和人群一致性是具有良好的重復性和可比性的基礎；微RNA分子很小，相對其他類型RNA，微RNA比較容易從細胞內保留并釋放至血循環內，更能夠反映疾病的特征，可能具有較好的疾病特異性。循環微RNA的這些優勢說明，它具有成為疾病分子標記物的極佳條件。

綜上所述，血清微RNA具有成為鼻咽癌診斷標志物的優勢和特點，本發明公開了一種新型鼻咽癌分子標志物，其檢測方法也具有快速、無創的特點，具有重要的臨床意義和價值。

發明內容

本發明的目的在于提出MiR-17，miR-20a，miR-29c和miR-223能作為鼻咽癌發生風險的分子標志物，通過檢測待檢測者血清中的表達水平，用于鼻咽癌高危人群的篩查。

發明人在前期研究工作中通過篩查正常人和鼻咽癌人群的血清miRNA表達譜，發現miR-17，miR-20a，miR-29c和miR-223的表達水平存在明顯的差異，通過大樣本病例分析，證明miR-17，miR-20a，miR-29c和miR-223能聯合作為鼻咽癌的分子標志物。

本發明檢測外周血中miR-17，miR-20a，miR-29c，和miR-223的方法為：(1)收集待測個體外周血，促凝，收集血清；(2)抽提血清中總RNA，以總RNA為模板將miRNAs逆轉錄為cDNA；(3)用miR-17，miR-20a，miR-29c和miR-223stem-loop引物進行Real-Time?PCR擴增，獲得4個miRNAs(miR-17，miR-20a，miR-29c和miR-223)表達Ct值；(4)計算A值＝(Ct_miR-29c+Ct_miR-223)-(Ct_miR-17+Ct_miR-20a)，判斷A值＞-3.30為陽性，可提示鼻咽癌風險陽性；A值＜-3.30為陰性，可提示鼻咽癌風險陰性。

本發明定量的檢測外周血中miR-17，miR-20a，miR-29c和miR-223表達狀況，從而預測鼻咽癌的患病風險，用于鼻咽癌高危人群的篩查，并對鼻咽癌患者做出快速、無創性診斷。

附圖說明