[發明專利]豬輪狀病毒ΔVP8*亞單位重組蛋白及其應用

有效

• 申請號: 201310222004.X
• 申請日: 2013-06-06
• 公開（公告）號: CN103304642A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 冉旭華;翟軍軍;聞曉波;魏曉曼;張峣;曹思;張春山;崔玉東
• 申請（專利權）人: 黑龍江八一農墾大學
• 主分類號: C07K14/14
• 分類號: C07K14/14;C12N15/46;C12N15/63;A61K39/15;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 大慶市建華專利事務所 23119
• 代理人: 孫薇

技術領域

本發明屬于動物分子生物學和基因工程領域，涉及一種豬輪狀病毒ΔVP8*亞單位重組蛋白及其應用。

背景技術

輪狀病毒（Rotavirus，RV）是無囊膜、分節段的雙股RNA病毒，屬于呼腸孤病毒科，是引起嬰幼兒和各種幼齡動物病毒性腹瀉的主要病原之一。仔豬輪狀病毒腹瀉是由豬輪狀病毒（porcine?rotavirus，PRV）引起的一種以腹瀉、厭食、嘔吐、脫水為特征的急性傳染病。本病多發生于晚秋、冬季和早春，各種年齡的豬皆可感染，感染率最高可達90%～100％。易繼發細菌性感染，導致仔豬死亡率升高，造成嚴重的經濟損失。豬輪狀病毒感染呈世界范圍分布，給養豬業帶來了極大的危害。

輪狀病毒含有6種結構蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4、VP6和VP7），其中VP4和VP7可以獨立地誘導中和抗體。VP7蛋白含有的抗原表位大都是構象性的，原核系統的表達產物無法折疊形成VP7蛋白的天然構象，且不能進行蛋白質翻譯后的糖基化修飾。而VP4蛋白上的抗原表位多為線性，且該蛋白不需翻譯后修飾，這為研制亞單位疫苗提供了理論依據。VP4由基因片段4編碼，動物輪狀病毒的VP4蛋白由776個氨基酸組成，分子量為88kDa，占病毒蛋白總量的1.5%。VP4經胰蛋白酶作用在241位或247位氨基酸處可裂解為兩條長度不等的肽段VP8*和VP5*，其中VP8*靠近氨基端，它能吸附宿主細胞唾液酸，接著羧基端的VP5*在丐粘素和熱休克蛋白的共同作用下進入細胞。研究發現，VP8*是一種重要的中和抗原蛋白，其蛋白亞基上含有5個線性B細胞表位，其中3個表位參與病毒的中和反應。VP8*包含了VP4的主要抗原位點，且負責VP4特異性中和反應，而且VP8*片段具有高度的型特異性。由于VP4基因片段較長（2359bp），因此目前原核表達完整的VP4蛋白存在困難，因此，這提示了我們可以利用VP8*蛋白片段來開發新型PRV亞單位疫苗，為基因工程亞單位疫苗的研制奠定基礎。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種豬輪狀病毒ΔVP8*亞單位重組蛋白及其編碼基因。

本發明的第二個目的是提供一種重組蛋白及其編碼基因，該重組蛋白是在豬輪狀病毒ΔVP8*亞單位重組蛋白中增加破傷風毒素T細胞表位P2。

本發明的第三個目的是提供上述兩種重組蛋白的用途。

本發明通過以下技術方案來實現：

一、一種豬輪狀病毒ΔVP8*亞單位重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。編碼上述的豬輪狀病毒ΔVP8*亞單位重組蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。應理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領域技術人員可以根據需要使用適合特定物種表達的密碼子。

該重組蛋白的制備方法如下：

（1）以豬輪狀病毒OSU株為實驗材料，首先獲取cDNA；

（2）根據GenBank檢索號為X13190.1的序列設計引物，PCR獲得目的片段ΔVP8*，其中，引物序列如下：

上游引物：5'-GATCCATATGTTATTAGATGGCCCATACCAACC-3'（SEQ?ID?No.3），斜體劃線部分為NdeI酶切位點；

下游引物：5'-ATAGAAAGCTTTCCATGATTGATATACTCAGTAC-3'（SEQ?IDNo.4），斜體劃線部分為HindIII酶切位點；

（3）將目的片段ΔVP8*克隆至pET28a載體中，獲得表達載體pET28a-ΔVP8*；

（4）將上述表達載體轉化至大腸桿菌感受態細胞BL21(DE3)pLysS，IPTG誘導表達獲得重組蛋白。

三、一種重組蛋白，該重組蛋白是在豬輪狀病毒ΔVP8*亞單位重組蛋白的氨基酸增加破傷風毒素T細胞表位P2，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.6所示。編碼上述重組蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.5所示。

該重組蛋白的制備方法如下：

（1）以豬輪狀病毒OSU株為實驗材料，首先獲取cDNA；

（2）根據GenBank檢索號為X13190.1的序列設計引物，PCR獲得目的片段P2-ΔVP8*，其中，引物序列如下：