[發明專利]分型診斷口蹄疫病毒的引物、探針及其試劑盒和使用方法

無效

• 申請號: 201310220173.X
• 申請日: 2013-06-05
• 公開（公告）號: CN103667520A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 鄒明強;薛強;孫芳芳
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種用于病毒分型診斷的引物、探針及其試劑盒和使用方法，尤其涉及一種用于診斷O型、AsiaI型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型口蹄疫病毒的引物、探針及其試劑盒和使用方法，屬于口蹄疫病毒檢測領域。

背景技術

口蹄疫(Food?and?Mouth?Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Food?and?Mouth?Disease?Virus，FMDV)感染引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性和可快速遠距離傳播的動物疫病，主要感染偶蹄類動物，如豬、牛、羊等。口蹄疫一旦暴發，將會給畜牧養殖業，尤其是進出口貿易造成巨大損失，因此該病也被世界動物衛生組織(OIE)列為15個A類動物疫病之首，我國政府也將FMD排在14個一類動物傳染病的第一位。

口蹄疫病毒有七種血清型，其中O型和A型分布最廣，除歐洲外，在非洲、南亞、中東和南美許多地區也有發生，C型僅局限于印度次大陸，AsiaI型通常只發生在亞洲，STA1、2、3型只見于非洲地區，在我國曾出現過O型、A型和AsiaI型的疫情。七種血清型的主要區別在于其結構蛋白氨基酸組成數與排列順序的不同引起的蛋白二級結構的差異，其中VP1基因最容易發生變異，不同血清型之間的變異率約為30％-50％，其次是VP3和VP2。口蹄疫病毒血清型分類最早是在1922年，由法國學者Vallee和Carre通過田間重復感染現象的觀察和交叉免疫試驗發現的，1997年，我國臺灣FMD大流行時曾致使新生仔豬的死亡率高達100％，造成了重大的經濟損失。

目前，口蹄疫的實驗室診斷方法主要包括病原生物學方法、免疫學方法和分子生物學方法三大類。其中，病原生物學方法和免疫學方法對實際樣品具有一定的依賴性，靈敏度不高，尤其是對于免疫動物、感染并有癥狀動物與已感染但尚未出現發病癥狀動物難以進行區分和及時有效的判斷，而基于核酸檢測的分子生物學方法可從根本上解決這一難題，具有特異性強、靈敏度高等特點。因此，實時熒光定量PCR核酸分子診斷方法成為口蹄疫病毒診斷的標準方法。然而，現有標準方法只針對通用型口蹄疫病毒檢測，不能對口蹄疫病毒進行分型鑒別，需在實驗室操作，檢測周期較長。

反向斑點雜交(reversedot?blot，RDB)是1985年由Saiki等提出的一種斑點雜交技術，并將其應用于血液病和Beta地中海貧血的檢測，RDB只需要相對較短的寡核苷酸探針就能提供明顯的雜交信號，通過調整雜交條件可以鑒別出模板中一個堿基的差異。該技術較正向斑點雜交和凝膠電泳轉印雜交具有快速、簡便、敏感性高、特異性強的特點，尤其是在基因分型、基因突變檢測、病原體的檢測等方面有其獨特的優勢，但是傳統的雜交技術都需要再高溫條件下進行，需要一定的儀器設備的支持，在實地應用的過程中仍然會受到一定的限制。

發明內容

本發明的主要目的是提供一套用于分型診斷口蹄疫病毒的引物和探針，可用于O型或者AsiaI型或者A型或者C型或者SAT1型或者SAT2型或者SAT3型的口蹄疫病毒或者其中的兩種或者三種或者四種或者五種或者六種或者七種血清型口蹄疫病毒的聚合酶鏈反應-反向斑點雜交分型診斷。

所述引物針對各血清型的保守片段設計，O型、AsiaI型、A型、C型四種口蹄疫病毒共用一條上游引物(SEQ?No.1)、SAT1型、SAT2型、SAT3型三種口蹄疫病毒共用一條上游引物(SEQ?No.2)，七種口蹄疫病毒共用一條下游引物(SEQNo.3)，引物5’端均使用生物素進行標記，其核苷酸序列為：

所述探針針對各血清型的型特異性片段設計，探針5’端均加有10個T尾，其核苷酸序列為：