[發(fā)明專利]三葉青種質(zhì)資源的離體保存及保存后恢復(fù)生長的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310218348.3
• 申請日: 2013-06-04
• 公開（公告）號: CN103299907A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 彭昕
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 寧波市鄞州金源通匯專利事務(wù)所(普通合伙) 33236
• 代理人: 唐迅

技術(shù)領(lǐng)域

?本發(fā)明涉及一種植物組培技術(shù)，特別是一種三葉青種質(zhì)資源離體保存及保存后恢復(fù)生長的方法。

背景技術(shù)

三葉青(Tetrastigma?hemsleyanum)又名金線吊葫蘆，可用于治療高熱、肝炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及病毒性腦膜炎等多種疾病,也是抗腫瘤常用藥物。其主要活性成份黃酮對肝癌、腸癌、胃癌和血癌細胞株具有“促凋亡作用”。目前該植物野生資源瀕臨滅絕,且其對生長環(huán)境的要求非常苛刻，人工栽培難度大，三葉青藥材的來源主要靠扦插，移栽等，但各項技術(shù)尚不成熟，繁殖系數(shù)低，開發(fā)和利用受到極大限制。2011年三葉青被列入“浙江省首批農(nóng)作物種質(zhì)資源保護名錄”。在保護現(xiàn)有野生資源的同時，利用植物組織培養(yǎng)方法對三葉青種質(zhì)資源進行離體快繁和試管保存顯得十分重要。

離體繼代培養(yǎng)技術(shù)正日益成為種質(zhì)資源保存的常用手段。但利用繼代培養(yǎng)的方法進行種質(zhì)保存，一個比較普遍的問題就是繼代頻繁。每一次繼代都可能造成交叉污染，而當保存量較大時，繼代培養(yǎng)所消耗的人力和物力成本很高。不僅如此，一些保存的植物組織培養(yǎng)物，經(jīng)過多次繼代還會引發(fā)遺傳變異。國內(nèi)外對三葉青的研究主要集中在臨床應(yīng)用、化學(xué)成份以及藥理作用方面，組織培養(yǎng)、快繁技術(shù)目前有少量報道，但有關(guān)其種質(zhì)資源的離體保存技術(shù)以及其遺傳評價均未見報道。

另外，三葉青種質(zhì)資源田間種植難度大，保存工作量大，易受環(huán)境氣候及病蟲害影響，而組織培養(yǎng)正常繼代保存轉(zhuǎn)接頻繁、成本高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決上述技術(shù)的不足而提供一種不但保存10個月后植株生長正常，而且保存材料的后代未發(fā)生遺傳性變異的三葉青種質(zhì)資源的離體保存及保存后恢復(fù)生長的方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所提供的一種三葉青種質(zhì)資源的離體保存方法，是以三葉青帶腋芽的莖尖為外植體，用8%次氯酸鈉表面消毒8min，無菌水沖洗2次，再用0.1%升汞滅菌5min，無菌水沖洗8次后，將其切割成1cm左右的莖段接入培養(yǎng)基1中，所述培養(yǎng)基1是在每升MS培養(yǎng)基中含3mg6-BA和0.5mgNAA；20天后將萌發(fā)的腋芽轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基2中進行擴繁，所述培養(yǎng)基2是在每升MS培養(yǎng)基中含2mg?6-BA和1mg?NAA；再30天后將增殖的不定芽轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基3中誘導(dǎo)生根，所述培養(yǎng)基3是在每升1/2MS培養(yǎng)基中含2mg?IBA；再20天后將形成的試管苗轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基4中，所述培養(yǎng)基4是在每升pH值為6.4的1/4MS培養(yǎng)基中附加了100mg水楊酸(SA)、0.2?mg青鮮素、0.3mg6-BA、重量比為10%?蔗糖、?重量比為2%?瓊脂，將已轉(zhuǎn)入試管苗的培養(yǎng)基4于低溫(8±1)℃和光照600?Lux(6h/天)條件下進行保存。

在此，所述的6-BA是6－芐氨基嘌呤；所述的NAA是吲哚乙酸；所述的IBA是吲哚丁酸；所述的1/2MS培養(yǎng)基、1/4MS培養(yǎng)基都是市售商品的商品名，可以直接購買到的，在此也不作詳細說明。

發(fā)明所提供的一種三葉青種質(zhì)資源的離體保存后恢復(fù)生長的方法，是將上述所述試管苗在保存材料恢復(fù)生長培養(yǎng)基中恢復(fù)生長，所述的保存材料恢復(fù)生長培養(yǎng)基是在每升MS培養(yǎng)基中附加了0.5?mg赤霉素、3mg6-BA和0.5mg?NAA。

本發(fā)明提供的三葉青種質(zhì)資源的離體保存方法，即三葉青試管苗的保存方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點和積極效果:

1.?本發(fā)明首次利用在培養(yǎng)基中添加水楊酸和青鮮素保存三葉青試管苗，并首次利用附加了0.5?mg/L赤霉素的MS培養(yǎng)基對保存后的三葉青試管苗進行恢復(fù)培養(yǎng)。

2.本發(fā)明所提供的方法用于三葉青離體保存，試管苗保存10個月后存活率仍為100%，且植株生長正常，與常規(guī)正常培養(yǎng)基上的試管苗僅能存活3個月相比，大大延長了繼代培養(yǎng)時間，使繼代間隔由平時的1～2個月繼代1次轉(zhuǎn)為10個月繼代1次。因此該方法可防止普通的傳代保存法由于多次傳代后造成的種性退化及病毒感染，保證種質(zhì)的優(yōu)良性和純潔性。

3.減少生產(chǎn)中繁重的繼代工作，而且降低生產(chǎn)操作過程中不必要的人力、物力資源的浪費，為實際生產(chǎn)降低生產(chǎn)成本和提高經(jīng)濟效益提供必要的途徑。

4.與傳統(tǒng)的三葉青田間種植保存相比，打破了植物生長季節(jié)的限制，可隨時提供材料，工作量小，同時具有節(jié)省貯存空間，便于運輸和交流等優(yōu)點。

5.可避免該瀕危種質(zhì)資源的流失。

6.本發(fā)明方法保存10個月的三葉青試管苗，其后代POD同工酶酶譜及引物810的ISSR擴增譜帶與對照沒有差異，說明保存材料穩(wěn)定，沒有發(fā)生遺傳變異。

附圖說明