[發明專利]結核分枝桿菌特異性融合蛋白疫苗AB及其制備和應用

有效

• 申請號: 201310217506.3
• 申請日: 2013-06-03
• 公開（公告）號: CN103304670A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 吳雪瓊;梁艷;張俊仙;陽幼榮
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三〇九醫院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;A61K39/04;A61P31/06
• 代理公司: 北京市廣友專利事務所有限責任公司 11237
• 代理人: 耿小強

1.一種結核分枝桿菌特異性融合蛋白疫苗AB，由Ag85A蛋白抗原表位和Ag85B蛋白抗原表位依次連接形成，蛋白疫苗AB的氨基酸序列如序列表中序列3所示。

2.根據權利要求1所述的結核分枝桿菌特異性融合蛋白疫苗AB，其特征在于：所述的Ag85A蛋白的抗原表位位于融合蛋白AB的氨基端，Ag85B蛋白的抗原表位位于融合蛋白AB的梭基端。

3.一種結核分枝桿菌特異性融合蛋白疫苗AB的制備方法，包括如下步驟：

（1）兩個蛋白抗原表位融合的設計：分析結核分枝桿菌Ag85A、Ag85B的基因序列和蛋白質結構，確定兩個蛋白抗原表位融合的區域、組合和順序，所述Ag85A蛋白抗原表位的核苷酸優化序列如序列表中序列1所示，所述Ag85B蛋白抗原表位的核苷酸優化序列如序列表中序列2所示；依次將Ag85A和Ag85B蛋白抗原表位連接形成融合蛋白；Ag85A蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Ag85B蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端；

（2）兩個蛋白融合的克隆

①設計與合成擴增Ag85A抗原表位的一對引物

上游引物：

5’－GCAATTCCATATGTTTTCTCGT－3'，

下游引物：

5'－CCGCTCGAGTTTGAGAAAGG－3'，

在Ag85A蛋白編碼基因的上游引物添加Nde?I酶切位點，在Ag85A蛋白編碼基因的下游引物添加Xho?I酶切位點，將PCR擴增產物用Nde?I和Xho?I雙酶切后，插入用Nde?I和Xho?I雙酶切后的pET-30a質粒載體中，轉化到大腸桿菌DH5α受體菌中，經過質粒提取，經T7和T7t雙向測序驗證，獲得核苷酸序列與設計完全一致的重組質粒A/pET-30a；

②設計與合成擴增Ag85B抗原表位的一對引物

上游引物：

5’－GCAATTCCATATGGGATCCGGTGGTGGCTTTTCTC－3'，

下游引物：

5'－CCGCTCGAGTTTAGCCTGCACCCAGAGAGG－3'，

在Ag85B蛋白編碼基因的上游引物添加Nde?I酶切位點，在Ag85B蛋白編碼基因的下游引物添加Xho?I酶切位點，將PCR擴增產物用Nde?I和Xho?I雙酶切后，插入用Nde?I和Xho?I雙酶切后的pET-30a質粒載體中，轉化到大腸桿菌DH5α受體菌中，經過質粒提取，經T7和T7t雙向測序驗證，獲得核苷酸序列與設計完全一致的重組質粒B/pET-30a；

③用限制性內切酶BamH?I和Xho?I分別雙酶切A/pET-30a質粒和B/pET-30a質粒，通過轉接酶將兩個片段連接后，轉化到大腸桿菌BL21（DE3）受體菌中，經過質粒提取，經T7和T7t雙向測序驗證，獲得核苷酸序列與設計完全一致的重組質粒AB/pET-30a，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，并使Ag85A蛋白抗原表位與Ag85B蛋白抗原表位之間通過連接臂相聯接。

4.權利要求1或2所述的結核分枝桿菌特異性融合蛋白疫苗AB在制備預防或治療結核病的藥物或疫苗中的應用。