[發明專利]一種利用藍藻生產咖啡酸的方法

有效

• 申請號: 201310213780.3
• 申請日: 2013-05-31
• 公開（公告）號: CN103243124A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發明（設計）人: 何慶芳;張燕;薛勇;畢玉平;陳高;葛海濤;楊連群;范仲學;王俊燕;于金慧;董學衛;彭振英;邊斐
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院高新技術研究中心
• 主分類號: C12P7/42
• 分類號: C12P7/42;C12N15/74;C12R1/01
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

1.一種利用藍藻生產咖啡酸的方法，其特征在于，步驟如下：

（1）將核苷酸序列如SEQ?ID?NO.13所示的上臂基因插入質粒pBluescript?II?SK+的KpnI-XhoI內切酶酶切位點之間，將核苷酸序列如SEQ?ID?NO.14所示的下臂基因插入質粒pBluescript?II?SK+的SpeI-SacII內切酶酶切位點之間，將核苷酸序列如SEQ?ID?NO.15所示的卡納抗性片段插入質粒pBluescript?II?SK+的BamHI-PstI內切酶酶切位點之間，將核苷酸序列如SEQ?ID?NO.16所示的PsbA2啟動子插入質粒pBluescript?II?SK+的SalI-EcoRI內切酶酶切位點之間，將核苷酸序列如SEQ?ID?NO.17所示的5ST1T2PCR轉錄終止子插入質粒pBluescript?II?SK+的PstI-SmaI內切酶酶切位點之間，制得重組空白質粒；

（2）將核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所述的基因片段插入步驟（1）制得的重組空白質粒的EcoRI-PstI內切酶酶切位點之間，制得重組質粒；

（3）將步驟（2）制得的重組質粒轉化集胞藻Synechocystis?sp.PCC6803，制得轉基因集胞藻；

（4）將步驟（3）制得的轉基因集胞藻擴大培養后，經提取，制得咖啡酸。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（4）的擴大培養，步驟如下：

將轉基因集胞藻接種于BG-11液體培養基中，制得原藻液，在28～32℃的條件下培養至OD₇₃₀值為0.6～0.8時，經3000rpm離心10min，收集藻細胞，然后用原藻液1/10體積的新鮮BG-11液體培養基懸浮藻細胞，并添加對香豆酸至終濃度為0.5μM/L，置于28～32℃的條件下培養3天，收集培養液。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的BG-11液體培養基，每升組分如下：

BG-11母液10ml，濃度為6mg/ml的檸檬酸鐵銨溶液1ml，濃度為20mg/ml的Na₂CO₃溶液1ml，濃度為30.5mg/ml的K₂HPO₄溶液1ml，水定容至1L；

上述BG-11母液，每升組分如下：

NaNO₃149.6g，MgSO₄·7H₂O7.5g，CaCl₂·2H₂O3.6g，檸檬酸0.6g，pH8.0、濃度0.25M的NaEDTA溶液1.12ml，微量元素溶液100ml，水定容至1L；

上述微量元素溶液，每升組分如下：

H₃BO₃2.86g，MnCl₂·4H₂O1.81g，ZnSO₄·7H₂O0.22g，Na₂MoO₄·2H₂O0.39g，CuSO₄·5H₂O0.079g，Co(NO₃)₂·6H₂O0.049g，水定容至1L。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（4）的提取，步驟如下：

取4ml濃縮培養后的培養液，經離心，取上清液，調pH至5.0，-20℃保存過夜，經等體積乙酸乙酯萃取，濃縮后的殘留物用80%的甲醇溶解，制得咖啡酸。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述離心條件為：13000rpm離心2min。