[發(fā)明專利]一種基因轉(zhuǎn)染載體及其制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310213542.2
• 申請日: 2013-05-31
• 公開（公告）號: CN103289101A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程義云;邵乃敏
• 申請（專利權(quán)）人: 華東師范大學(xué)
• 主分類號: C08G83/00
• 分類號: C08G83/00;C08G73/04;C12N15/87
• 代理公司: 上海麥其知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及高分子化學(xué)、有機(jī)合成以及生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型的基因轉(zhuǎn)染載體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

基因轉(zhuǎn)染是指將外源基因?qū)爰?xì)胞，從而獲得新的遺傳性狀的過程。基因轉(zhuǎn)染載體是基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的核心，理想的基因轉(zhuǎn)染載體應(yīng)具備如下特點(diǎn)：高轉(zhuǎn)染效率，低細(xì)胞毒性，生物安全性好，價(jià)格低廉等。當(dāng)前使用的基因轉(zhuǎn)染載體主要包括病毒類載體和非病毒類載體。主要的應(yīng)用研究仍采用轉(zhuǎn)染效率高的病毒類載體，但病毒類載體存在攜帶基因能力有限以及安全性隱患等問題。

含有氨基的聚合物已被廣泛地應(yīng)用于基因運(yùn)輸方面，其所攜帶的氨基具有質(zhì)子化的性能，使它能容易結(jié)合基因分子形成復(fù)合物，并通過胞吞方式將其運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，隨后通過質(zhì)子海綿效應(yīng)保護(hù)基因分子免于在內(nèi)涵體中降解，進(jìn)一步從中逃逸并將基因分子釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)錄，翻譯等過程，實(shí)現(xiàn)有效的基因輸送。另外，含有氨基的聚合物的化學(xué)組成為非免疫原型的單體化合物，作為基因轉(zhuǎn)染載體時(shí)減少了病毒類和蛋白類基因轉(zhuǎn)染載體的安全隱患。因此，高效安全的特點(diǎn)使得含有氨基的聚合物成為病毒、脂質(zhì)體以及聚電解質(zhì)類基因載體的潛在替代品。

但是，以含有氨基的聚合物為基礎(chǔ)的基因轉(zhuǎn)染載體普遍面臨的高的材料成本、復(fù)雜的合成步驟、聚合物的化學(xué)組成不穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)染效果不穩(wěn)定、需要多重修飾來提高基因轉(zhuǎn)染效率、以及高基因轉(zhuǎn)染效率伴隨而來的高細(xì)胞毒性等一系列問題，始終沒有得到改善、解決。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明克服現(xiàn)有的普遍的含有氨基的聚合物基因轉(zhuǎn)染材料的不足，創(chuàng)新地提出了一種新的基于樹形高分子和二氨基三嗪功能基團(tuán)的基因轉(zhuǎn)染載體，是由二氨基三嗪基團(tuán)共價(jià)連接到樹形高分子表面制備而成的基因轉(zhuǎn)染材料，所述樹形高分子的伯胺基團(tuán)與二氨基三嗪衍生物通過化學(xué)反應(yīng)相連，可作為易于合成、轉(zhuǎn)染效果穩(wěn)定、高效、安全、價(jià)格低廉的基因轉(zhuǎn)染載體進(jìn)行應(yīng)用。本發(fā)明基因轉(zhuǎn)染載體的制備方法利用一系列樹形高分子作為骨架，然后二氨基三嗪衍生物共價(jià)連接到樹形高分子表面制備而成的基因轉(zhuǎn)染載體，獲得同時(shí)具備合成簡易、高轉(zhuǎn)染效率、低毒、低成本的基因轉(zhuǎn)染載體。

本發(fā)明提供一種如式(1)所示的基因轉(zhuǎn)染載體，其包括樹形高分子骨架和二氨基三嗪功能基團(tuán)；所述二氨基三嗪基團(tuán)共價(jià)連接在所述樹形高分子骨架表面；其中，所述樹形高分子包括聚酰胺-胺樹形高分子(polyamidoamine，PAMAM)和聚丙烯亞胺樹形高分子(poly(propyleneimine)，PPI)；所述樹形高分子表面為伯胺基團(tuán)；

????式(1)；

式(1)中，R為如式(2)所示的聚酰胺-胺樹形高分子或如式(3)所示的聚丙烯亞胺樹形高分子；Y為NH、O、S、或CH₂基團(tuán)；x為樹形高分子表面連接的二氨基三嗪的數(shù)量，x為1-1024的整數(shù)；

????式(2)；

????式(3)；

式(2)和(3)中，M是樹形高分子的核心，其組成包括氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、葵二胺、或1，12-十二烷二胺；n是1-10的整數(shù)；m是2-4的整數(shù)。

本發(fā)明還提出了一種基因轉(zhuǎn)染載體的制備方法，通過反應(yīng)將二氨基三嗪基團(tuán)共價(jià)連接到樹形高分子表面，制備得到所述基因轉(zhuǎn)染載體，即式(1)所示的基因轉(zhuǎn)染載體。具體地，將二氨基三嗪衍生物及樹形高分子溶解于水或有機(jī)溶劑，加入一定量的堿，在一定溫度下攪拌后冷卻，除去未反應(yīng)的二氨基三嗪衍生物以及相關(guān)溶劑，即得到所述的基因轉(zhuǎn)染材料。

本發(fā)明制備方法中，所述樹形高分子如式(2)所示的聚酰胺-胺樹形高分子或如式(3)所示的聚丙烯亞胺樹形高分子。所述二氨基三嗪衍生物為2-氟-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪，2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪，2-溴-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪，2-碘-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪。

本發(fā)明制備方法中，所述有機(jī)溶劑包括甲醇，乙醇，二甲亞砜，N，N-二甲基甲酰胺，或四氫呋喃。所述堿為碳酸氫鈉，三乙胺，N，N-二異丙基乙胺。

本發(fā)明制備方法中，所述反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)至120小時(shí)。所述反應(yīng)溫度為0攝氏度到150攝氏度。

本發(fā)明還提出了如式(1)所示的基因轉(zhuǎn)染載體在體外或體內(nèi)作為核酸分子的輸送載體的應(yīng)用。

本發(fā)明應(yīng)用中，所述核酸包括DNA、siRNA、shRNA、或經(jīng)修飾后的核酸等。

本發(fā)明還提出了一種復(fù)合物，其包括含有如式(1)所示的基于樹形高分子和二氨基三嗪功能基團(tuán)的基因轉(zhuǎn)染載體和核酸，由所述基因轉(zhuǎn)染載體攜帶所述核酸。