[發明專利]功能肽TPS在特異性篩選內皮祖細胞中的應用

有效

• 申請號: 201310205659.6
• 申請日: 2013-05-29
• 公開（公告）號: CN103293322A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 牛寶龍;李文鳳;魏麗喬;馬森源;高向華
• 申請（專利權）人: 太原理工大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 太原科衛專利事務所(普通合伙) 14100
• 代理人: 戎文華

技術領域

本發明涉及一種蛋白融合生物技術，特別涉及一種內皮祖細胞特異性結合的功能多肽TPS與真菌疏水蛋白HFBI的融合。

背景技術

誘導人工心血管植入物表面自發地形成類似天然血管的內膜組織（體內內皮化）是解決植入后血栓形成、內膜增生和再狹窄的一個根本措施。捕獲循環血液中的內皮祖細胞在人工心血管植入物表面定居生長是目前內皮化誘導研究的新策略。

構建與靶細胞特異性結合的表面以捕獲循環血液中內皮祖細胞主要有在材料表面固定靶細胞特異性膜蛋白的抗體、核酸適配子和多肽適配子等3?種方法。TPS(TPSLEQRTVYAK)?Veleva是等利用噬菌體展示文庫篩選到的可與血液來源的內皮祖細胞特異性結合的功能小肽。傳統的誘導人造血管生成的方法是將篩選得到的TPS特異功能性小肽利用化學合成的方法獲得并與所研究的血管支架材料共價結合，從而研究目的小肽分子在支架材料上固定特定細胞的能力。但是該方法只適合在培養基中沒有血清存在的情況下TPS?對內皮祖細胞具有高度的特異性，當有血清存在的時候，因血清中大量的因子都吸附到了TPS支持物的表面，覆蓋了TPS特異性吸附內皮祖細胞的能力，這樣就嚴重的制約了人造血管的再生與其臨床上的應用。這就需要找到一種適合TPS?修飾支架的介質，使得TPS?能緊密的排列在支架表面，在增加單位面積捕獲內皮祖細胞細胞個數的同時對血清中其他因子也起到了排斥作用，從而提高TPS?修飾的支架對內皮祖細胞的特異性吸附能力。

真菌疏水蛋白是由絲狀真菌在生長的特定時期產生的一類具有特殊理化性質的分泌型的小分子量、疏水性蛋白質。它們可以通過自組裝在兩相界面形成兩親性蛋白膜，改變介質表面的親水性和疏水性，是已知表面活性最高的蛋白之一，具有很高的理論價值和應用價值。國際上，真菌疏水蛋白的在醫學上的應用主要集中在以下幾個方面：

蛋白（酶）、核酸和細胞的固定化、生物傳感器電極的修飾、生物活性包被材料真菌疏水蛋白具有非常穩定的自我裝配特性，而且無細胞毒性，也無強免疫原性，這使得它們在生物材料的表面包被應用中成為熱點，例如在外科手術器械包被和內科移植等領域均有廣闊的應用前景。真菌疏水蛋白膜可以增加疏水性材料表面的可濕性，從而提高疏水表面的生物適應性；真菌疏水蛋白膜也可以防止體內非特異性的蛋白結合和細菌粘附；另一方面，疏水蛋白被覆層可以增強如纖維原細胞等的粘附，在組織工程方面也有應用前景。

在瑞氏木霉疏水蛋白HFBI研究中，HFBI-EGI的融合蛋白可以高效地固定在硅烷化玻璃或是特富龍等疏水性材料表面，在疏水支持物表面形成緊密結合的剛性表面層。西班牙Palomo博士研究小組將真菌疏水蛋白用于層析柱中，發現真菌疏水蛋白可以作為一種良好的中介，利用蛋白之間的相互作用，將脂肪酶固定于介質表面。但是利用真菌疏水蛋白的自組裝成膜固定化能力與其它功能肽融合后將其固定到層析柱或者其它固體支持物表面，要比常規的酶固定化技術使目的蛋白更有效的結合。

因此，通過蛋白融合技術將疏水蛋白HFBI與TPS融合，一方面利用疏水蛋白的高效自組裝成膜能力，有效地提高單位面積TPS?分布；另一方面，利用HFBI在接近中性條件下帶有大量負電荷，進而阻止血清中其它因子的吸附，使得在有血清存在的情況下提高TPS?對人內皮祖細胞的特異吸附能力。

發明內容

發明目的：構建表達一種融合蛋白，用于改善細胞培養支架的生物相容性和內皮祖細胞的特異性篩選能力。并提供一種功能肽TPS在特異性篩選內皮祖細胞中的應用。

本發明的技術方案如下：

內皮祖細胞特異性結合多肽適配子TPS的氨基酸序列：

TPSLEQRTVYAK

內皮祖細胞特異性結合的多肽適配子TPS的基因序列：

ACTCCATCTTTAGAACAAAGAACTGTTTACGCTAAG

疏水蛋白HFBI的基因序列為：

AGCAACGGCAACGGCAATGTTTGCCCTCCCGGCCTCTTCAGCAACCCCCAGTGCTGTGCCACCCAAGTCCTTGGCCTCATCGGCCTTGACTGCAAAGTCCCCTCCCAGAACGTTTACGACGGCACCGACTTCCGCAACGTCTGCGCCAAAACCGGCGCCCAGCCTCTCTGCTGCGTGGCCCCCGTTGCCGGCCAGGCTCTTCTGTGCCAGACCGCCGTCGGTGCT

疏水蛋白HFBI的氨基酸序列為：