[發(fā)明專利]用于STAT3靶基因相關(guān)miRNA的回收和鑒定的探針、試劑盒和方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310202355.4
• 申請(qǐng)日: 2013-05-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103320431A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘇小平;曹雪濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陶家蓉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及靶基因相關(guān)miRNA回收、鑒定技術(shù)的實(shí)施方法及應(yīng)用，尤其是在動(dòng)物細(xì)胞系中的應(yīng)用，例如在人腫瘤細(xì)胞株中的實(shí)施方法和用途。

背景技術(shù)

MicroRNA(miRNA)是長(zhǎng)約20～24nt、非編碼的微小RNA，它們通過(guò)抑制mRNA翻譯或者促進(jìn)mRNA降解對(duì)靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控(Bartel,D.P.，Cell.2004,116:281-297)。MiRNA是一種調(diào)控細(xì)胞功能作用非常廣泛的非編碼小RNA，幾乎控制著每一個(gè)生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞的分化、發(fā)育、增殖和凋亡。此外，現(xiàn)在研究表明miRNA表達(dá)水平失調(diào)與很多疾病包括腫瘤、自身免疫性疾病、糖尿病、心臟病等疾病密切相關(guān)(Hobert,Trends?Biochem.Sci.2004,29:462;Lu,J.等，Nature.2005,435:834-838;Li,Q.J.等，Cell.2007,129:147-161;Cheng,H.Y.等，Neuron.2007,54:813-829;Chang,T.C.等，Mol?Cell.2007,26:745-752;He,L.等，Nature.2005,435:828-833;Care,A.等，Nat?Med.2007,13:613-618)。

MiRNA的生物學(xué)功能是人們非常關(guān)注的問(wèn)題，而miRNA靶基因的確定是研究miRNA生物學(xué)功能的關(guān)鍵，目前有關(guān)miRNA靶基因的確定主要靠計(jì)算機(jī)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法(Daniel,W.T.等,Nucleic?Acids?Res.2011,39:6845-53;U.A.等,Gene.2009,451:1-5)。

目前，常用的計(jì)算機(jī)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件有miRanda、PicTar、TargetScan、PITA和RNA22。生物信息學(xué)方法主要是利用某種算法對(duì)靶基因樣本進(jìn)行評(píng)分及篩選，因?yàn)槿藗冊(cè)谘芯窟^(guò)程中發(fā)現(xiàn)，miRNA和靶基因間的作用具有一定規(guī)律性。因此，目前的預(yù)測(cè)方法雖然各不相同，但主要遵循以下幾個(gè)常用原則(Krek,A.等,Nat?Genet.2005,37:495-500;Lall,S.等,Curr?Biol.2006,16:460-71;Lewis,B.P.等,Cell.2005,120:15-20；Kiriakidou,M.等,Genes?Dev.2004,18:1165-78；Kertesz,M.等,Nat?Genet.2007,39:1278-84;Miranda,K.C.等,Cell.2006,126:1203-17)：

(1)miRNA與其靶位點(diǎn)的互補(bǔ)性；

(2)miRNA靶位點(diǎn)在不同物種之間的保守性；

(3)miRNA-mRNA雙鏈之間的熱穩(wěn)定性；

(4)miRNA靶位點(diǎn)處不應(yīng)有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)；

(5)miRNA的5'端與靶基因的結(jié)合能力強(qiáng)于3'端。

然而，使用計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)動(dòng)物中miRNA靶基因是一件十分困難的事情，這主要是因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞中miRNA和其靶基因采取非完全互補(bǔ)的模式。目前已知的miRNA靶基因及其確切的靶點(diǎn)并不多，在算法編寫(xiě)過(guò)程中沒(méi)有足夠的已知樣本可參考，即使不斷增加和改進(jìn)限制條件，也難以獲得同時(shí)具有高特異性和高靈敏度的算法。并且，目前對(duì)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)出來(lái)的靶基因也沒(méi)有一個(gè)快速的高通量鑒定方法，這也在很大程度上影響了對(duì)算法準(zhǔn)確性的評(píng)估，因而無(wú)法對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。

由于計(jì)算機(jī)模擬在預(yù)測(cè)miRNA靶基因時(shí)存在一定的局限性，很多學(xué)者希望能夠利用生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法直接尋找miRNA靶基因。生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法尋找miRNA靶基因主要有以下幾種方式：

(1)從mRNA水平尋找miRNA靶基因(Lim,L.P.等,Nature.2005,433:769-773)，通過(guò)miRNA影響mRNA的穩(wěn)定性來(lái)尋找miRNA的靶基因。但是，該方法存在不能區(qū)分是直接靶基因還是間接靶基因的缺點(diǎn)。同時(shí)，這種方法在尋找起翻譯抑制作用的miRNA靶基因時(shí)存在困難；