[發明專利]分枝桿菌鑒定方法、試劑盒、通用引物對及rpsA基因的應用

有效

• 申請號: 201310185213.1
• 申請日: 2013-05-17
• 公開（公告）號: CN104164475B
• 公開（公告）日: 2017-05-03
• 發明（設計）人: 黃海榮;劉冠;段鴻飛;姜廣路;戴廣明
• 申請（專利權）人: 北京市結核病胸部腫瘤研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京志霖恒遠知識產權代理事務所(普通合伙)11435
• 代理人: 孟阿妮,郭棟梁

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及微生物的分子鑒定領域；尤其涉及一種分枝桿菌鑒定方法、試劑盒、通用引物對及rpsA基因的應用。

背景技術

結核病仍然是嚴重的公共衛生問題，尤其是在發展中國家。據WHO統計世界人口的1/3有結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染，是全世界感染性疾病中的第一大殺手。我國是全世界22個結核病高負擔國家之一，活動性肺結核病人數居世界第二位。目前我國全年齡組結核菌感染率為44.5％，全國約5.5億人受到結核菌感染。而非結核分枝桿菌（Non-tuberculous mycobacteria，NTM）感染在我國總體也呈上升趨勢，1984/1985年第二次全國結核病流行病學調查(簡稱流調)NTM發病率為4.2%，1990年第三次流調為4.9%，2000年第四次流調則增至11.1%，而在2010年第五次流調中則上升為22.9%。然而這個比率遠低于歐洲和美國的發病率（＞40%）。按照流行病學的理論，隨著國家結核病防治規劃效果的日益顯現，NTM在結核病總體發病中所占的比率逐步提高。因此，預計我國未來NTM的發病率仍有上升空間，所以對NTM的研究也應該提高重視程度。

NTM病臨床表現與結核病相似，在無菌種鑒定結果的情況下，經常被誤診為結核病。而臨床對于感染了結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌的患者治療方案完全不同：非結核分枝桿菌多數對常用的抗結核藥物天然耐藥（NTM耐多藥率高達83.7%），但一些廣譜的抗生素對治療NTM感染有效，而這些廣譜抗生素對結核分枝桿菌感染的抗菌作用很弱，甚至沒有作用；常見的能夠致病的NTM有30余種，針對不同種NTM治療的藥物選擇存在較大差異。因此在臨床上，快速準確地判定患者是否存在NTM感染，是何種NTM感染，對臨床治療具有重要意義。

目前臨床上常用的鑒定NTM的方法分為兩大類，一類是傳統生化的方法，操作繁瑣并且不夠準確，所以已基本被棄用，僅有含對硝基苯甲酸（PNB）的選擇性培養基法仍然廣泛使用，用于初步區分結核分枝桿菌復合群（MTC）和NTM；另一類為分子生物學方法，以比較同源基因/序列的序列差異來鑒定NTM至種水平，該方法以操作簡單、快速、能夠鑒定分枝桿菌至種水平等優勢成為目前最常用的方法，并且已經衍生出了各類商業試劑盒(如DNA芯片技術,線形探針雜交技術)應用于臨床。目前最見的用于分枝桿菌菌種鑒定的同源基因/序列包括：16srRNA編碼基因、16s-23s rRNA間區（ITS）、hsp60和rpoB基因。采用單一的基因或現有基因組合對NTM的鑒別依然僅能鑒定常見致病NTM中的一部分，少量NTM由于種間序列的高度同源性，現有的鑒定技術不能夠區分。如鳥分枝桿菌復合群、海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌，即使聯合使用16s rRNA編碼基因和ITS,也不能區分。現有的鑒別技術鑒定為同一種的分枝桿菌，有可能被新的標識鑒定為幾種分枝桿菌或分為幾個亞種，如經16s rRNA基因和ITS鑒定為膿腫分枝桿菌的菌群，在結合使用hsp60和rpoB基因后，進一步分為了膿腫分枝桿菌、M.massiliense和M.bolletii。目前對分枝桿菌菌種鑒定技術主要關注的是其鑒定NTM至種的能力，實際上通過更多的分子標識的使用，有可能將同一種NTM分為更多的亞型，更細致的分型不僅有助于流行病學研究，而且當與患者的病史結合時，還有可能建立不同亞型與患者發病的聯系，由此了解宿主的免疫機制與發病機制，類似的研究在國際上還未被關注過。因此，發現更多的分子標識，提高分枝桿菌菌種鑒定技術的鑒別能力，對臨床診斷和治療具有重要的參考價值。

發明內容

本發明的目的是提供一種分枝桿菌鑒定方法、試劑盒、通用引物對及rpsA基因的應用。

本發明第一方面提供了rpsA基因在分枝桿菌菌種鑒定中的應用。

rpsA基因（作為一種新的分子標識）用于在分枝桿菌菌種鑒定中，通過一種通用引物對，包括正向引物和反向引物，擴增分枝桿菌（Mycobacterium）的rpsA基因，從而鑒定或區分不同的分枝桿菌。優選的，其中所述正向引物為5’-CCCTACATCGGCAAGGAG-3’(SEQ ID No：1)，所述反向引物為5’–TGTCGATGACCTTGACCATC-3’（SEQ ID No：2）。其中，正向引物，位于結核分枝桿菌的rpsA基因的487-504位置，gene bank號為NC_000962.2；反向引物位于結核分枝桿菌的rpsA基因的1032-1051位置，gene bank號為NC_000962.2。