[發明專利]一種細毛羊毛囊干細胞分離培養方法

有效

• 申請號: 201310178143.7
• 申請日: 2013-05-15
• 公開（公告）號: CN103275922A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 郭婷婷;楊博輝;郭健;牛春娥;岳耀敬;劉建斌;孫曉萍;馮瑞林;郎俠;李范文;王天翔;李桂英;張世棟
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種細毛羊毛囊干細胞分離培養方法。

背景技術

體外培養細毛羊毛囊干細胞，對于探討與其生長相關的因子、激素等作用機理，改善羊毛品質，提高產毛量具有重要的經濟意義和價值。毛囊干細胞(hair?follicle?stem?cells，FSC)被認為是慢循環細胞(slow?cycling?cell)或極少循環細胞(rarely?cycling?cell)，具有干細胞的一般特點，即自我復制性(self-renew)和多項潛能性(multi-potent)，可分化成毛囊、皮脂腺和表皮，對毛發的再生以及毛色的影響起著重要的作用(Wakayamat等，2001)。目前多數研究認為毛囊干細胞位于毛囊的隆突部和外根鞘的最外層。毛囊隆突部的細胞具有干細胞的特征，在培養狀態下毛囊隆突部位的細胞克隆形成能力強。國內外學者運用細胞培養技術，將毛囊隆突部分離出來，并成功培養毛囊隆突部干細胞(Taylor等，2000；Zhang等，2006；Honda等，2006)。毛囊(Hair?follicle)是表皮向真皮凹陷后形成的能控制毛發生長的皮膚附屬器官，是由胚胎期神經外胚層與間充質相互作用，最終發育形成的由多層細胞組成的、具有合成多種特異角質蛋白功能的復雜的動態器官，具有獨特的結構和周期性再生的能力。毛囊在形成和分化過程中至少涉及到20余種不同的細胞群，主要由毛乳頭、毛母質、內根鞘和外根鞘等細胞組成。其中，外根鞘細胞(Outer?root?sheath?cell，ORSC)作為一種重要的毛囊上皮細胞，因具有高度增生的潛能，在毛發再生、傷口愈合、初級毛囊和次級毛囊分化等生理過程中均起著重要作用，因而越來越受到高度關注。毛囊是控制毛發周期性生長的重要結構，它是一個多層細胞組成的特殊器官，而細毛羊的羊毛品質及產量都取決于綿羊皮膚組織結構和毛囊性狀。但是如何在體外培養中大量獲得毛囊隆突部干細胞，且盡量減少其分化，仍是有待解決的問題。體外分離培養細毛羊毛囊干細胞，建立良好的培養體系，對于闡明細毛羊毛囊干細胞生物學特性和探討毛囊的生長調節機制具有重大意義，在畜牧生產上也有著廣闊的應用前景。

毛發的周期性自我更新以及生長依賴于毛囊干細胞的周期性增殖和分化(Paus等，2004)。Taylor等(2000)通過3H-TdR等一系列標記細胞試驗提出假設：毛囊隆突部可能是干細胞貯存處。Morris等(1994)通過放射性BrdU標記技術，發現約10％左右標記滯留細胞(label?retaining?cells，LRCs)存在于表皮基底細胞層中，而其他絕大多數陽性細胞存在于毛囊外根鞘隆突部位。Oshima等(2001)通過轉基因鼠證實每個毛發周期中毛母質細胞是隆突部HFSCs來源的，此后不斷有研究證實HFSCs定位于隆突部(Ohyama，2007；Waters等，2007)。Levy等(2005)利用顯微解剖、組織切片以及皮片異種移植模型研究發現，鼠毛囊隆突部為其外根鞘一系列不連續隆起，人毛囊隆突部位于其外根鞘最外層靠近立毛肌插入點處。研究者將毛囊經胰酶消化后，利用膠原包被法培養外根鞘細胞獲得成功。Jones等(1996)利用干細胞對細胞外基質的粘附性進行了體外分離、純化表皮干細胞的實驗，采用快速粘附于VI型膠原的方法成功的富集了表皮干細胞(Bickenbach等，1999)。Zhang等(2006)利用中性分散酶分離毛囊隆突區，培養獲得了毛囊隆突區干細胞。到目前為止，體外外根鞘細胞培養技術較成熟，應用最廣的是顯微分離培養法。但是，由于毛囊干細胞存在部位隱蔽，獲得的外根鞘細胞中毛囊干細胞數量十分有限，限制了毛囊干細胞的研究。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術存在的缺陷，提供一種細毛羊毛囊干細胞分離培養方法，建立與完善細毛羊體外培養細毛羊毛囊干細胞系(Fine?wool?sheep?hair?follicle?stem?cell?line)的構建方法，不僅可為闡明毛囊的生長發育規律、影響因素及其調控機制提供研究模型；為提高細毛羊毛產量和羊毛品質的育種改良奠定基礎；還可以為提高羊毛品質、數量和毛皮花紋品質乃至醫學領域的人類毛發再生研究等奠定基礎。

其技術方案如下：

一種細毛羊毛囊干細胞分離培養方法，包括如下步驟：