[發明專利]一種細毛羊毛囊干細胞分離培養方法

有效

• 申請號: 201310178143.7
• 申請日: 2013-05-15
• 公開（公告）號: CN103275922A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 郭婷婷;楊博輝;郭健;牛春娥;岳耀敬;劉建斌;孫曉萍;馮瑞林;郎俠;李范文;王天翔;李桂英;張世棟
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種細毛羊毛囊干細胞分離培養方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)活體采集皮膚樣品：無菌操作切取細毛羊耳部皮膚0.5cm×0.5cm大小的含完整毛囊的皮膚組織樣品，將樣品用碘酒消毒，濃度為75％酒精消毒2次，再用生理鹽水反復清洗，然后用含有青霉素-鏈霉素的D-Hank’s平衡鹽溶液快速沖洗3～5次，迅速將樣品放入無血清的DMEM/F12培養液中，于冰盒內帶回實驗室，在12h內進行分離培養；

(2)在玻璃培養皿中，將軟骨與皮膚剝離，在體式顯微鏡下用解剖針固定皮膚，在不損傷毛囊的前提下將毛囊周圍組織盡量剔除，將皮膚標品在無菌條件下用眼科剪剪成小條，加入2.4U/mL的I型膠原酶，4℃消化12h后，終止消化，用眼科鑷夾住毛囊遠端從脂肪端拉出，收集形態完好且處于生長期的毛囊，分別在皮脂腺的下方和豎毛肌的上方橫切獲得中間毛囊隆突區；

(3)分離獲得毛囊隆突區后，再置于0.25％胰酶中37℃消化30min，終止反應，1200r/min離心收集細胞后接種于100μg/mL的IV型膠原包被的培養皿中，30min后吸出上層未貼附的角質形成細胞和毛囊真皮成纖維細胞；

(4)將培養皿中添加10ng/ml表皮生長因子、10ng/ml類胰島素生長因子-I、0.5μg/ml氫化可的松的DMEM/F12工作培養液，置于37℃，飽和濕度，5％CO2培養箱中培養；

(5)當毛囊干細胞生長至會合狀態后，進行傳代培養，首先棄掉舊培養液，D-Hank’s液沖洗細胞一次，加入1ml濃度為0.25％的胰蛋白酶浸潤細胞數秒，棄去后，再加入4ml濃度為0.25％的胰蛋白酶，常溫下消化處理5min，加入含10ng/ml?EGF、10ng/mlIGF-I、0.5μg/ml氫化可的松和2％FBS的DMEM/F12維持培養液，置于37℃，飽和濕度，5％CO₂培養箱中培養；

(6)選擇對數生長期細胞，利用傳代培養的方法制成細胞懸液，然后加入含10％DMSO和30％FBS的DMEM/F12凍存培養液并分裝入無菌凍存管中，封口，標記；將凍存管依次置于4℃1h，-20℃1h，-70℃12h，最后移入液氮中長期保存細胞；復蘇細胞時，用40℃溫水快速解凍細胞，按5×105個/ml的細胞密度接種于培養瓶。