[發(fā)明專(zhuān)利]用于分析(R)-特異性ω-轉(zhuǎn)氨酶的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310176572.0
• 申請(qǐng)日: 2010-08-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103472093A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬蒂亞斯·赫內(nèi);烏韋·博恩朔伊爾;卡倫·羅賓斯;塞巴斯蒂安·舍茨勒
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 羅扎股份公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N27/00
• 分類(lèi)號(hào): G01N27/00
• 代理公司: 隆天國(guó)際知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 72003
• 代理人: 任曉華;吳小瑛

本發(fā)明是2010年8月13日提交的，發(fā)明名稱(chēng)為“用于鑒別和制備(R)-特異性ω-轉(zhuǎn)氨酶的方法”，申請(qǐng)?zhí)枮?01080039297.2的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于篩選、表征和制備(R)-特異性ω-轉(zhuǎn)氨酶的方法，由此獲得的ω-轉(zhuǎn)氨酶及其在各種氨基轉(zhuǎn)移過(guò)程中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

手性胺在制藥、農(nóng)用化學(xué)和化學(xué)工業(yè)中發(fā)揮著重要作用。它們常被用作中間體或合成子(synthones)以制備各種生理學(xué)，如藥學(xué)活性物質(zhì)，如頭孢菌素或吡咯烷衍生物。在手性胺的眾多應(yīng)用中，僅有一種特定的光學(xué)活性形式((R)或(S)對(duì)映體)具有生理學(xué)活性。因此，需要提供一種制備光學(xué)活性形式的手性胺的方法。

這些需求通過(guò)以下方法得到部分滿(mǎn)足，即通過(guò)加入手性羧酸使非對(duì)映體鹽結(jié)晶來(lái)制備手性胺(Breuer?et?al.,Angewandte?Chemie(2004)116,806-843)。其它化學(xué)方法使用通過(guò)還原含C=N雙鍵的前手性前體的對(duì)映選擇性合成。

在已用于合成光學(xué)活性氨基酸和胺的若干酶促方法中，由于其用于光學(xué)活性胺的不對(duì)稱(chēng)合成的潛力，ω-轉(zhuǎn)氨酶(ω-TAs)最近已得到更多關(guān)注，其常被用作多種藥物制備的結(jié)構(gòu)單元(building?blocks)。

ω-轉(zhuǎn)氨酶是PLP(磷酸吡哆醛)依賴(lài)性酶，其催化氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。當(dāng)采用ω-轉(zhuǎn)氨酶時(shí)，主要可經(jīng)由兩種反應(yīng)策略來(lái)制備所謂的對(duì)映體富集和/或純光學(xué)活性胺：(i)從酮起始的不對(duì)稱(chēng)合成，和(ii)從外消旋胺起始的動(dòng)力學(xué)拆分。雖然ω-轉(zhuǎn)氨酶總體上顯示出良好的對(duì)映選擇性，但它們尚未被頻繁地用在不對(duì)稱(chēng)合成中，盡管在不對(duì)稱(chēng)合成中理論上可能的產(chǎn)率是100%。使用ω-轉(zhuǎn)氨酶的不對(duì)稱(chēng)合成的一個(gè)特殊要求是平衡向產(chǎn)物側(cè)移動(dòng)，特別是當(dāng)使用諸如丙氨酸等氨基酸作為氨基供體時(shí)，因?yàn)樵诖饲闆r下平衡狀態(tài)在底物(酮、丙氨酸)側(cè)，而不在產(chǎn)物(胺、丙酮酸鹽)側(cè)；另一個(gè)要求是酶必須具有最佳的對(duì)映選擇性，而ω-轉(zhuǎn)氨酶并非一向如此。因此，ω-轉(zhuǎn)氨酶主要用于外消旋胺的動(dòng)力學(xué)拆分，其中不需要最佳的對(duì)映選擇性。因此，雖然已經(jīng)研究了外消旋胺的動(dòng)力學(xué)拆分，但50%最大產(chǎn)率的限制很大程度上阻礙了其應(yīng)用。另一方面，不對(duì)稱(chēng)合成需要將不利的平衡向合成光學(xué)純胺的單個(gè)對(duì)映體的方向移動(dòng)，這是能夠在工業(yè)規(guī)模上使用轉(zhuǎn)氨酶的有效方法的一個(gè)重要先決條件。WO2007/093372公開(kāi)了這類(lèi)方法。

EP0?987?332A1公開(kāi)了通過(guò)微生物酶，特別是源自節(jié)桿菌(Arthrobacter?sp.)的(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶來(lái)制備光學(xué)活性氨基化合物，即(R)-氨基化合物的方法。EP1?038?953A1公開(kāi)了另一種(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶，但其源自金色分支桿菌(Mycobacterium?aurum)。

Iwasaki等(Biotechnol.Let.2003(25),1843-1846)、Koszelewski等(Adv.Synth.Catal.2008(350),2761-2766)和Iwasaki等(Appl.Microbiol.Biotechnol.2006(69),499-505)公開(kāi)了源自節(jié)桿菌的R-特異性轉(zhuǎn)氨酶。通常通過(guò)選擇得自于如土壤樣品的微生物并在培養(yǎng)中將其富集來(lái)完成提供有用(S)-或(R)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶的微生物的鑒別(Jun等,App.Microbiol.Biotechnol.2004(70),2529-2534和Shin等(Biosc.Biotechnol.Biochem.2001(65),1782-1788))。特別地，全部所述的R-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶均通過(guò)富集培養(yǎng)獲得。此種方法耗時(shí)，這是因?yàn)閷?duì)于有效的方法，通常優(yōu)選在諸如大腸桿菌(Escherichia?coli)等異源生物體中過(guò)表達(dá)酶。這需要從野生型生物體中分離基因序列，但DNA序列的克隆不總能成功并且是極為耗時(shí)的過(guò)程。

特別地，在工藝開(kāi)發(fā)和新型ω-TA的鑒別期間，酶的純化及其酶促性質(zhì)的表征很受人關(guān)注。然而，由于通常通過(guò)諸如HPLC或毛細(xì)管電泳(CE)等低通量方法確定ω-TA活性，所以在一定程度上，酶性質(zhì)的確定通常是限速步驟。