[發明專利]一種感受態宿主細胞的制備方法以及一種快速高效將外源物質轉入宿主細胞的方法及其應用

在審

• 申請號: 201310173077.4
• 申請日: 2013-05-10
• 公開（公告）號: CN103387946A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發明（設計）人: 張成崗;范磊;吳永紅;李雨;周浪;高艷;李偉光;李志慧
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所;蘇州科景生物醫藥科技有限公司;北京百樂寧生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/14;C12N5/04;C12N5/07;C12N1/16;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12N15/09;C12R1/19
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

1.一種感受態宿主細胞的制備方法，包括以下步驟：

1）純化、復蘇及預處理宿主細胞；

2）用真空冷凍干燥技術處理宿主細胞，得到感受態宿主細胞。

2.根據權利要求1所述方法，其特征在于：所述宿主細胞為任意一種原核或真核宿主細胞，包括細菌細胞、真菌細胞、植物細胞和動物細胞等，例如為大腸桿菌和酵母。

3.根據權利要求1或2所述方法，其特征在于：步驟1）所述純化宿主細胞是指將原宿主細胞在固體培養基表面劃線培養，得到單克??；復蘇宿主細胞是指將純化的宿主細胞重新培養一定時間，使其從靜止狀態重新進入到生長狀態；預處理宿主細胞是指將復蘇的宿主細胞擴大培養至相應濃度。

4.根據權利要求3所述方法，其特征在于：步驟1）純化、復蘇及預處理宿主細胞的過程如下：

（1）純化宿主細胞：用接種環取原始宿主細胞分區劃線接種于適用于培養宿主細胞的固體培養基，在適宜條件下培養，得到宿主細胞單克隆；針對大腸桿菌的為LB固體培養基，其配方為胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，瓊脂粉15g/L；針對酵母的為YPD固體培養基，其配方為酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂粉20g/L；適于大腸桿菌的培養條件為37℃，12～16h；適于酵母的培養條件為30℃，48h；

（2）復蘇宿主細胞：挑取宿主細胞單克隆接種到5mL適用于宿主細胞的生長培養基中，在適宜溫度下（大腸桿菌37℃；酵母培養30℃）220rpm復蘇過夜（12～16小時）；適于大腸桿菌的為LB培養基，其配方為胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L；適于酵母的為YPD培養基，其配方為酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L；

（3）預處理宿主細胞：將經復蘇的宿主細胞按照體積比1:100的比例接種到100mL新鮮的步驟（2）所述的生長培養基中，在適宜溫度下（大腸桿菌37℃；酵母培養30℃）220rpm搖菌至OD₆₀₀=0.6～1.0；吸取500μｌ菌液分裝至1.5mL?EP管中，-80℃冰箱預冷凍12～24小時以上。

5.根據權利要求1至4任一所述方法，其特征在于：步驟2）所述真空冷凍干燥技術處理，是將步驟1）處理后的宿主細胞用真空冷凍干燥儀預冷30～120分鐘待溫度達到-54℃并穩定在該溫度后，再真空冷凍干燥宿主細胞12～24小時或以上。

6.權利要求1至5任一所述方法制備得到的感受態宿主細胞，且所述感受態宿主細胞在0-4℃溫度下仍具備生物活性。

7.一種將外源物質轉入宿主細胞的方法，利用權利要求1至5任一所述方法制備得到的感受態宿主細胞，進一步包括以下步驟：

3）制備待轉化的外源物質的水溶液；

4）用所述水溶液對步驟2）得到的感受態宿主細胞進行快速復水，得到已轉化有外源物質的宿主細胞菌液；

以此將外源物質轉入宿主細胞。

8.根據權利要求7所述方法，其特征在于，所用外源物質包括核酸（脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)）、蛋白質、寡肽、氨基酸等生物活性物質。

9.根據權利要求7或8所述方法，其特征在于，所述步驟3）中所述外源物質水溶液使用ddH₂O，配制好的外源物質水溶液在37℃水浴鍋中保溫30～60分鐘。

10.根據權利要求7或8或9所述方法，其特征在于，步驟4）快速復水的操作為：將步驟2）的感受態宿主細胞迅速加入步驟3）配制的外源物質的水溶液，輕輕混勻后置于適宜溫度下（大腸桿菌37℃；酵母培養30℃）恒溫箱中220rpm振蕩培養45～60分鐘；外源物質水溶液的用量與冷凍干燥前的宿主細胞等體積。

11.一種生成外源物質轉化菌的方法，其特征在于，用條件培養基篩選權利要求7至10任一所述方法得到的已轉化有外源物質的宿主細胞，得到的單克隆即為外源物質轉化菌。